電針對APP/PS1轉基因小鼠海馬P-糖蛋白和間質液β淀粉樣蛋白水平的影響

周英奕 高譽珊 李麗娜 毛穎秋 張磊 張學婷 裴亞妮 薛衛國

摘要 目的：通過觀察電針對于APP/PS1雙轉基因小鼠海馬P-糖蛋白表達和腦間質液Aβ水平的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的作用機制。方法：12只4月齡雄性APP/PS1轉基因鼠，隨機分為電針組和模型組;6只4月齡雄性C57BL鼠為正常對照組。電針“百會”“涌泉”2周后，采用腦微透析檢測技術取小鼠腦間質液，Elisa法檢測小鼠間質液Aβ水平;免疫組化法觀察小鼠海馬P-糖蛋白表達情況。結果：免疫組化結果顯示，與正常對照組比較，模型組P-糖蛋白表達明顯減少;與模型組比較，電針組的表達相對增加。ELISA檢測顯示，與正常對照組比較，模型組的間質液Aβ明顯減少;與模型組比較，針刺組Aβ水平明顯下降。結論：電針可以降低腦間質液Aβ水平，并可以升高海馬內P-糖蛋白的表達。

關鍵詞 阿爾茨海默病;β淀粉樣蛋白;APP/PS1轉基因小鼠;腦組織間液;P-糖蛋白;電針

Effects of Electroacupuncture at Baihui （DU 20） and Yongquan （KI 1） on P-glycoprotein

and Brain Interstitial Fluid β-amyloid in Hippocampus in APP/PS1 Transgenic Mice

Zhou Yingyi1， Gao Yushan2， Li Li′na2， Mao Yingqiu2， Zhang Lei1， Zhang Xueting1， Pei Yani1， Xue Weiguo1

（1 School of Acupuncture， Moxibustion and Tuina， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2 School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：To observe the effect of electroacupuncture on the level of P-glycoprotein and brain interstitial fluid Aβ in hippocampus in APP/PS1 transgenic mice， and to explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of Alzheimer′s disease. Methods：Twelve male APP/PS1 transgenic mice were divided into electroacupuncture group and model group randomly. Six male C57BL mice were used as normal control group. The level of Aβ in the interstitial fluid of mice was detected by Elisa method after two weeks of electroacupuncture at Baihui （DU 20） and Yongquan （KI 1）. The expression of P-glycoprotein in hippocampus was observed by immunohistochemistry. Results：Immunohistochemical results showed that the expression of P-glycoprotein was significantly decreased （P<0.01） in the model group when compared with the normal control group， and the expression of P-glycoprotein in the EA group was significantly increased （P<0.05） compared with the model group. ELISA test showed that the level of brain interstitial fluid Aβ in the model group was lower （P<0.01） than the level in the control group significantly. Compared with the model group， the level of Aβ in the acupuncture group was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion：Electroacupuncture can decrease the level of brain interstitial fluid Aβ and increase the expression of P-glycoprotein in hippocampus， which may explain why the EA have effects on AD.

Key Words Alzheimer′s disease; β-amyloid; APP/PS1 transgenic mice; Brain interstitial fluid; P-glycoprotein; Electroacupuncture

中圖分類號：R277.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.040

阿爾茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）是一種慢性進行性疾病，是癡呆最常見的一種類型，主要臨床表現為認知功能障礙、漸進性記憶障礙等神經精神癥狀。AD的主要病理特征是由β淀粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉積導致形成的老年斑塊（Senile Plaques，SP）堆積[1-2]。Aβ級聯學說是目前國際較為公認的AD發病學說[3]，該學說認為腦中Aβ的生成與清除失衡導致的沉積，是形成淀粉樣斑塊的原因[4]。

研究認為Aβ在神經元外的沉積對神經元產生的損傷和破壞，是導致記憶AD病理改變的原因之一[5]。目前研究的靶點是通過降低腦內Aβ水平，減輕其神經毒性，緩解疾病進程。腦中的Aβ主要分為可溶性和不可溶性2種形式。腦組織間液（Brain Interstitial Fluid，ISF）是一個中間過程，可溶性Aβ由此進入不同代謝場所從而被進一步清除，因此觀測ISFAβ的含量對于腦內Aβ清除效果的評估具有重要意義[6]。腦內Aβ清除主要通過血-腦屏障（Blood-brain Barrier，BBB）途徑轉運，P-糖蛋白主要分布于P-糖蛋白主要分布在腦毛細血管內皮細胞（BCECs）上，研究表明其是轉運Aβ外流出腦的重要載體，對Aβ水平的變化產生重要影響[7-8]。

本實驗選擇APP/PS1雙轉基因鼠，采用“益腎祛濁”法[9]，對“百會”“涌泉”兩穴進行電針治療，觀察其對間質液Aβ水平的影響;取樣海馬組織，觀察P-糖蛋白在該區域的表達，從而探討電針作用在AD疾病上的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 4月齡、雄性C57 BL鼠6只作為正常對照組;4月齡、雄性APP/PS1轉基因鼠12只作為模型組和針刺干預組。動物從南京大學模式動物研究所購入。

1.1.2 試劑與儀器 人Aβ42Elisa超敏試劑盒（美國，Life technologies公司，KHB3544）;P-糖蛋白兔單克隆抗體（美國，Abcam，ab170904），免疫組化超敏試劑盒（兔）（邁新生物科技，KIT-9706）;DAB顯色試劑盒（邁新生物科技，DAB-0031）;無菌針灸針（中研太和，0.25 mm×13 mm）;韓氏穴位神經刺激儀（北京華衛產業開發公司，HANs LH202H型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 4月齡、雄性APP/PS1轉基因鼠12只隨機等分為2組：電針觀察組（A）和模型組（M）;4月齡、雄性C57BL鼠6只作為正常對照組（C）。實驗已被北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會通過。

1.2.2 針刺干預方法 電針觀察組的小鼠取俯臥位，使用自制鼠袋束縛，將其放置于治療臺上，根據大鼠針灸穴位圖譜以及比較解剖學的方法選穴定位，在頭頂正中取“百會”穴，平刺3～5 mm;在足底的前、中1/3交界處取“涌泉”穴，平刺5～7 mm。電針正、負極分別接左、右側“涌泉”穴，頻率為1/50 Hz，采用疏密波，強度約0.3 Ma。以動物狀態穩定、不劇烈掙扎嘶叫為度。治療的時間為15 min，隔日針刺，共2周。正常對照組、模型組僅不進行針刺，其他條件均相同，用相同的自制鼠袋束縛，放置于治療臺上，束縛時間為15 min，隔日1次，共2周[10]。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 腦微透析取腦間質液（ISF）及ELISA檢測? 麻醉小鼠后，進行手術，將微透析探針放置于小鼠左側海馬C3區域處，探針（MAB公司，13.8.1）膜長為1 mm，膜截流分子量為10KD。夜間觀察小鼠的生命狀態良好，活動正常，于第2天將其送入CMA/120活動裝置，小鼠可在清醒狀態下在裝置內自由活動，方便進行長時間的微透析取樣，小鼠在運動過程中微透析探針所連接的細管不影響其活動。探針與CMA微量取樣系統通過細管連接，內外壓平衡1 h后，開始取樣腦間質液[11]。CMA微量取樣系統采用0.5 μL/min的灌流速度，灌流替代液為不含蛋白的人工腦脊液，每隔1 h得到1管透析液樣品。每只小鼠取4管腦組織間液，第1 h樣品為平衡內外壓時的取樣，故舍棄。

用人Aβ42Elisa試劑盒（美國，Life technologies公司，96T，KHB3544）檢測腦間質液Aβ42的含量。提前配置好標準品，濃度分別為100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.13 pg/mL、1.56 pg/mL以及0 pg/mL（僅標準品稀釋液）;ELISA檢測板第一排每孔只放入濃度依次遞減的標準品25 μL和25 μL稀釋液覆膜封板，其余每排各孔均加入25 μL待測樣品和25 μL稀釋液覆膜封板，于室溫下靜置孵育3 h。用1X的洗滌緩沖液洗板4次。每孔加入100 μL二抗（空白對照的空孔除外），覆膜封板，于室溫下靜置孵育30 min。1X的洗滌緩沖液充分洗板4次。每孔加顯色劑100 μL，輕震混勻，室溫下避光孵育30 min。每孔加入100 μL的終止液。酶標儀測吸光值，設定檢測波長為450 nm。用Excel軟件繪制蛋白標準品的曲線，根據計算出來的方程式計算樣品中Aβ42的濃度，再根據樣品稀釋情況換算海馬腦間質液中Aβ42的濃度。

1.2.3.2 腦組織取樣及免疫組化 取小鼠右側半腦，放置于4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（PBS），固定7 d。自來水流水沖洗后修塊，用石蠟包埋，從視交叉處開始，于冠狀軸切片，厚度為6 μm，1只小鼠切10～15張片。選取海馬結構完整且位于水平位的切片，進行免疫組化ABC法[11]。

免疫組化法具體操作步驟：脫蠟（二甲苯15 min，2次;100%無水乙醇5 min，2次;95%、90%、80%、70%乙醇依次浸泡切片5 min，均1次）;枸櫞酸鹽緩沖液熱修復抗原10 min;待恢復至室溫，PBS洗板3次;50 μL過氧化酶阻斷溶液（邁新生物科技，KIT-9706，A液）室溫孵育10 min;PBS洗板3次;山羊血清封閉液（邁新生物科技，KIT-9706，B液）孵育10 min;用濾紙吸干山羊血清，加兔抗鼠P-gp（美國，Abcam，ab170904）一抗以1：100稀釋，4 ℃孵育過夜;次日，PBS洗板5次，加入二抗（邁新生物科技，KIT-9706，C液）室溫孵育10 min，PBS洗板;再加入三抗（邁新生物科技，KIT-9706，D液）。PBS洗板3次，加入DAB顯色10 min;自來水充分沖洗后，蘇木素復染40 s;自來水浸泡5 min，脫水（70%、80%、90%、95%乙醇各5 min浸泡清洗，100%無水乙醇清洗5 min，共2次;100%二甲苯10 min，共2次）、樹脂封片。使用DXM1200相機，用Leica系統連接并采集圖像。

使用Leica圖像采集系統，取每只小鼠的1張免疫組化染色后的切片，在400倍放大下，取小鼠海馬內相同的3個視野拍照;采集圖片后，用Imagine Pro Plus（IPP）軟件算出每張圖片海馬區域內P-糖蛋白的積分光密度（IOD）總和，取每只動物所有圖片IOD的平均數，用此數據表示P糖蛋白的表達情況，進行統計學析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件，對腦組織間液Aβ的ELISA檢測結果和海馬P-糖蛋白的免疫組化檢測結果進行統計學結果分析。各組數據均服從正態分布，方差齊，故采用單因素方差ANOVA分析法;用LSD方法進行兩兩比較，分析各組間數據。以P<0.05為差異有統計學意義;P<0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA檢測間質液Aβ水平 腦微透析取樣各組小鼠海馬腦間質液，用ELISA法檢測其Aβ1-42水平。經統計學分析，模型組高于正常對照組（P<0.01）;電針組低于模型組（P<0.01）。見表1。

表1 電針對于各組間質液Aβ1-42水平的影響（±s）

注：與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，△△P<0.01

2.2 免疫組化法檢測P-糖蛋白 在海馬相同區域內，觀察P-糖蛋白表達情況，3組均存在P-糖蛋白陽性表達，且均表達于微血管壁上。正常對照組陽性表達面積最大，且顏色較深;模型組陽性表達面積明顯減少，顏色也明顯變淺;與模型組比較，電針觀察組陽性表達面積有所增加。見圖1。采用IPP軟件對P-糖蛋白的陽性表達IOD值進行半定量分析。兩兩比較可得，模型組海馬的P-糖蛋白IOD值大于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01）;電針觀察組海馬P-糖蛋白IOD大于模型組（P<0.05）。見表2。

圖1 小鼠海馬P-糖蛋白表達情況（免疫組化×400）

表2 各組小鼠海馬P-糖蛋白積分光密度（IOD）比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

3 討論

Aβ血管清除理論認為腦內Aβ的清除主要是通過BBB轉運的。Aβ經血腦屏障轉運入血包括兩步，即分別透過腦毛細血管內皮細胞（BCECs）細胞膜的基底側和基頂側，且這兩步都需經過特異性的轉運體或受體介導[12]。在BBB中，P-糖蛋白主要分布在腦毛細血管內皮細胞（BCECs）與血液循環接觸的腔面上，也就是BCECs的基頂部位[13-14]，是Aβ轉運出腦的重要轉運載體[15-16]。

腦組織間液（ISF）是Aβ進入不同代謝途徑的中間場所。在AD發病的早期階段，腦組織中的Aβ大多存在于腦組織細胞間液（ISF），為可溶性形式，另一部分存在于腦組織中。隨著AD疾病的進一步發展，可溶性Aβ經由血管途徑的清除能力逐漸下降，逐漸在腦中聚集、變性成不溶性Aβ形式，進一步沉積于腦血管壁形成腦血管淀粉樣變，這也是老年斑塊形成的主要原因。且研究表明，間質液Aβ水平對AD的干預早期較晚期有更明顯的效果[17]。因此，選擇4月齡的APP/PS1轉基因鼠，排除了老年斑生成對于可溶性Aβ水平的影響，在前期觀察電針對于間質液中可溶性Aβ水平的影響。近年來，越來越多的研究[18-19]采用腦微透析技術取樣，用于監測腦內Aβ水平的變化，其優勢是可進行在體、實時的取樣，且不干擾體內的正常生命活動[20]。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白（APP）經分泌酶切割而生成的，APP/PS1雙轉基因動物模型就是轉入了過度表達的人類基因APP和早老素1（PS1），因此過度生成的APP蛋白和分泌酶（于PS1基因相關），使腦內Aβ的生成增加。表1的結果也證實了相對于正常對照組，模型組的Aβ水平顯著增加，從而證實了APP/PS1模型選擇的正確性;Aβ的清除與其轉運蛋白的能力密切相關，因此通過對重要轉運蛋白P-糖蛋白水平的觀察，反映了APP/PS1鼠清除水平較C57BL鼠減低，從而導致老年斑塊的生成增多和出現的時間提前[21]，其神經毒性繼而引發一系列病理變化。故該模型能較好地模擬AD發病。

中醫認為AD的病位在腦，“血瘀痰阻”是其發病的主要病因病機。針刺“百會”“涌泉”2穴，上下相配，遠近相應，起到扶正固本、通絡祛濁的作用。通過對間質液Aβ水平變化的觀察，實驗證明轉基因模型鼠海馬腦間質液Aβ42水平大幅度增高，而電針能明顯降低腦間質液Abeta42水平。其降低可能由于電針降低了Aβ42生成或增加了Aβ42的清除。電針后P-糖蛋白水平的提高，說明經P-糖蛋白的腦微血管壁從腦間質液向外周血液的Aβ42清除，可能在降低腦間質液Aβ42水平中發揮一定的作用。

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