針刺足三里、曲池對MCAO模型大鼠梗死周圍組織PI3K/AKT信號通路表達的影響

唐冕 章琪 陳紅霞

摘要 目的：評價針刺曲池穴及足三里穴對MCAO模型大鼠運動功能的影響及觀察腦梗死灶周圍組織PI3K/AKT信號通路表達的變化。方法：將45只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組及干預組，各15只。假手術組僅予切開皮膚分剝離神經血管后縫合，模型組及干預組大鼠予線栓法進行MCAO模型制備，造模成功后干預組大鼠予針刺曲池穴及足三里穴，1次/d，30 min/次，假手術組及模型組大鼠僅模仿捉拿、回籠，連續(xù)干預14 d，用Homecage Scan行為學評價大鼠不同時間段運動能力的變化，免疫組化檢測PI3K、Bax的表達差異，免疫蛋白印跡（Western blotting）觀察AKT、p-Akt的濃度變化。結果：1）Homecage Scan行為學檢測顯示：假手術組大鼠未見明顯異常，造模大鼠出現(xiàn)明顯偏癱，隨著時間的推移模型組及干預組大鼠花費在行走、后肢站立、舔毛3種行為的時間逐漸延長，其中干預組改善得更為明顯（P<0.05）。2）造模組大鼠腦組織TTC染色出現(xiàn)明顯白色梗死區(qū)域，干預組大鼠梗死區(qū)域明顯小于模型組。3）免疫組化顯示造模后大鼠PI3K降低，Bax升高，針刺足三里穴及曲池穴可上調PI3K及AKT的磷酸化程度，抑制了Bax的表達;4）Western blotting顯示針刺足三里、曲池穴可上調造模大鼠AKT的磷酸化程度。結論：針刺曲池穴、足三里穴可改善腦缺血大鼠的神經缺損癥狀，其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路有關。

關鍵詞 MCAO模型;大鼠;曲池穴;足三里穴;PI3K/AKT信號通路

Effects of Acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） on the Expression of PI3K/AKT Signal Pathway

in the Infarction Surrounding Tissue of MCAO Model Rats

Tang Mian1， Zhang Qi2， Chen Hongxia3

（1 General Medicine， School of Clinical Medicine， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， Chia; 2 Traditional

Chinese Medicine Rehabilitation of Second Affiliated Hospital of Hubei University， Xianning 437100， China; 3 Department of

Pathophysiology， School of Basic Medical Sciences， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， China）

Abstract Objective：To evaluate the effects of the acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） on motor function of the MCAO model rats and to observe PI3K/AKT signal pathway expression changes in the surrounding tissue of cerebral infarcts. Methods：A total of 45 SD rats were randomly divided into blank group， model group and intervention group， with 15 in each group. Blank group received only the skin incision and sutured after vascular decollement， and model group and intervention group rats accepted string inserting method for MCAO model preparation. After the successful modeling， the rats of the intervention group acupunctured at LI 11 and ST 36， 1 time/day， 30 min/time. The rats of the blank group and the model group only imitate the arrest， and go back to the cages for 14 days continuous intervention. The athletic ability changes of rats in different periods by using Homecage Scan behavior were evaluated， and the expression differences of PI3K and Bax were detected by immunohistochemical. The concentration changes of AKT and p-AKT were observed by Western blotting. Results：1） Homecage Scan behavior test showed：the blank group rats did not see obvious abnormity， and the model rats appeared obvious hemiplegia. With the pass of time， rats in the model group and intervention group spent gradually extend time in walking， standing， licking the hairs， and the behavior of intervention group improved more significantly （P< 0.05）. 2） TTC staining of the brain tissue of rats in model group showed obvious white infarction area. The infarction area in the intervention group was significantly smaller than that in the model group. 3） Immunohistochemical revealed PI3K reduced and Bax increased after the model made， and acupunctured in Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） could increase extent of phosphorylation of PI3K and AKT， and inhibit the expression of Bax. 4） Western blotting showed that acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） could up-regulate AKT phosphorylation of modeling rats. Conclusion：Acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） can improve the neurological defect symptoms of cerebral ischemia rats， whose the mechanism may be associated with PI3K/AKT signal pathway.

Key Words MCAO model rats， Quchi （LI 11）， Zusanli（ST 36）， PI3K/AKT signaling pathway

中圖分類號：R255.2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.041

腦卒中以高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特點，被臨床視為繼腫瘤之后的難治疾病。其中70%為缺血性腦卒中，遺留明顯的肢體功能障礙，給個人、家庭及社會帶來沉重負擔。針灸對缺血性腦卒中的臨床療效已被多次證實，其作用機制目前尚處于不斷研究中。有研究發(fā)現(xiàn)利用針灸治療缺血性腦卒中時，急性期、恢復期及后遺癥期介入后療效存在統(tǒng)計學差異，說明針灸治療時機已然從恢復期/后遺癥期逐漸轉移至急性期[1]。近年來神經干細胞在修復受損神經方面的作用逐漸受到重視[2-3]，認為其自我更新及分化能力是治療神經受損疾病的切入點，這亦予研究針刺的作用機制帶來了新思路。查閱大量古籍及國內外文獻，我們發(fā)現(xiàn)曲池穴及足三里穴是治療腦卒中使用頻率最高的組合穴，亦有團隊研究[4-6]證實針刺曲池穴及足三里穴可誘發(fā)大鼠內源性神經干細胞增殖、遷移及分化，但其作用途徑目前尚無明確定論，PI3K/AKT信號通路可介導機體多個生物學效應，亦可調控神經干細胞的增殖、分化，基于此我們設想——針刺曲池穴及足三里穴與內源性NSCs之間的關系是否借助PI3K/AKT信號途徑進行橋接？我們將MCAO模型大鼠作為研究對象，進行針刺曲池穴及足三里穴干預，并對腦梗死灶周圍組織的PI3K/AKT通路標志性蛋白水平進行檢測，以期深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 將60只SPF級Sprague Dawley（SD）雄性大鼠納入研究，體重190～285 g，平均（250±10.24）g，鼠齡3～5個月，平均（4±0.25）個月，所有大鼠由凱學生物科技（上海）有限公司提供，飼養(yǎng)于湖北科技學院臨床醫(yī)學院動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度24～26 ℃，平均（18.23±5.3）℃。

1.1.2 試劑與儀器 氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液、PI3K、Akt、p-Akt、Bax、cleaved Caspase-3、β-actin一抗均購自美國Sigma公司;SDS-PAGE電泳膠購自碧云天生物公司，DAB免疫組化測試盒購自美國ZYMED公司，BCA蛋白試劑盒購自西安晶彩生物科技有限公司，10%水合氯醛購自凱福達化工有效公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組及干預組，各20只，3組大鼠一般資料均衡（P>0.05），具有可比性。2）模型制備：參照Zea-Longa線拴法復制大腦中動脈缺血模型，使用10%水合氯醛將各組大鼠充分麻醉，仰臥置于手術臺，切開頸部正中皮膚，將頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈、迷走神經剝離，將頸總動脈及頸外動脈結扎，在頸內動脈內側支做一切口，插入魚線2 mm左右，有抵觸感為度，隨后逐層縫合皮膚后消毒。假手術組大鼠僅接受切開皮膚，剝離血管神經后縫合皮膚消毒[7]。

1.2.2 干預方法 造模后3組大鼠均回籠飼養(yǎng)，假手術組及模型組大鼠每日模擬捉拿，干預組大鼠予電針曲池穴及足三里穴，定位參照李忠仁主編的《實驗針灸學》，針刺深度約3～4 mm，適當捻轉后接入華佗牌電針儀，疏密波，頻率1～10 Hz，刺激強度以大鼠肢體輕度抖動為度，1次/d，20 min/次，連續(xù)治療14 d直至大鼠斷頭處死。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 Homecage Scan行為學評價 于造模后第1天、第7天和第14天觀察各組大鼠在Home cage儀器中24 h的行為改變情況，每個觀察籠內僅有1只大鼠，供應足夠的水及食物，分析選取大鼠進食、后肢站立、行走、舔毛的行為時間。

1.2.3.2 腦梗死體積 隨機抓取各組3只大鼠，予10%水合氯醛將各組大鼠充分麻醉后經左心室灌洗生理鹽水，快速于冰山取腦，腦組織取出后立即置于-20 ℃冰箱冰凍20 min，隨后將腦組織沿著冠狀面平均切成5個薄片，每片厚度約2 mm，將薄片置于TTC溶液中進行染色，染色過程于避光環(huán)境中進行，染色接收取出腦組織腦片整齊排列于帶有刻度標尺的桌面，用高分辨率相機進行拍照后輸入計算機，用Image-ProPlus軟件進行腦梗死體積計算[8-9]。

1.2.3.3 免疫組化檢測PI3K、Bax表達水平 隨機抓取各組3只大鼠，予10%水合氯醛將各組大鼠充分麻醉后經左心室多聚甲醛，于冰山快速取出大腦，挖取梗死灶周圍組織切割成大小2 mm×2 cm的塊狀，進行常規(guī)流程石蠟包埋，隨后將制成切片，利用0.3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶，再用事先配制好的0.01 mol/LPBS沖洗3次，5 min/次，經過非特異性染色阻斷劑處理后加入PI3K、Bax一抗工作液，孵育過夜后再次用0.01 mol/LPBS沖洗3次，5 min/次，隨后加入羊抗兔的二抗工作液，孵育10～20 min后用PBS沖洗，加入DAB顯色劑后于3 min后自來水沖洗切片，蘇木素染色、脫水、封片后于顯微鏡下觀察，以以綜色然后為表達形式的陽性細胞數(shù)。

1.2.3.4 Western blot檢測AKT、p-AKT蛋白表達 隨機抓取各組3只大鼠，予10%水合氯醛將各組大鼠充分麻醉后經左心室灌洗生理鹽水，快速于冰山取腦，切取梗死灶周圍組織約200 mg，置于離心管中，加入1 mL蛋白裂解液，隨后于4 ℃，5 000 r/min條件下離心20 min，抽取上清液，利用DAB試劑盒對樣本蛋白質進行定量計算得出上樣量，隨后將樣本100 ℃金屬浴鍋中變性10 min，抽取實現(xiàn)計算好的樣本量加入配制的電泳凝膠中，將目的蛋白轉膜至PVDF膜中，用脫脂奶粉進行封閉后加入Akt、p-Akt及β-actin抗體，4 ℃孵育過夜后用TBS沖洗，加入相應的二抗后室溫再次孵育2 h，隨后滴入ECL顯影液于圖像分析系統(tǒng)（Model Gel Doc 2000）中進行顯色計算OD值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Excel表格對本研究數(shù)據(jù)進行登記，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢測，符合正態(tài)分布用t檢驗，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組Homecage Scan行為學比較 Homecage Scan行為學檢測顯示：假手術組大鼠未見明顯異常，造模第7天大鼠出現(xiàn)明顯偏癱，行走、后肢站立、舔毛時間明顯縮短，進食時間延長，隨著時間的推移模型組及干預組大鼠花費在行走、后肢站立、舔毛行為的時間逐漸延長，進食時間縮短，其中干預組改善得更為明顯（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠不同時間點行為學情況

2.2 各組腦梗死體積比較 造模組大鼠腦組織TTC染色出現(xiàn)明顯白色梗死區(qū)域，干預組大鼠梗死區(qū)域明顯小于模型組。見圖2。

圖2 各組腦組織冠狀面TTC染色

注：3組動物（n=3）典型冠狀面腦組織切片TTC染色;SC表示假手術組，IC表示模型組，DZ表示干預組

2.3 各組PI3K及Bax濃度變化 免疫組化顯示造模后大鼠PI3K降低，Bax升高，針刺足三里穴及曲池穴可上調PI3K水平，抑制了Bax的表達。見圖3、4。

圖3 各組PI3K濃度變化（IHC染色×200）

注：SC表示假手術組;IC表示模型組;DZ表示干預組

圖4 各組Bax濃度變化（IHC染色×200）

注：SC表示假手術組;IC表示模型組;DZ表示干預組

2.3 各組AKT及pAKT的濃度變化 Western blotting顯示針刺足三里、曲池穴可上調造模大鼠AKT的磷酸化程度。見圖5。

圖5 各組腦組織tAkt、pAKT蛋白檢測

注：（A）Western blot法檢測各組（n=3）大鼠腦梗死灶周圍組織t-Akt、p-Akt的濃度，β-actin作為內參蛋白。注SC表示假手術組，IC表示模型組，DZ表示干預組

3 討論

幾千年來大量醫(yī)學資料均證實針刺穴位對多數(shù)疾病有理想的療效，近年來大量的研究通過臨床或動物實驗證實了腧穴的特異性[10-12]。足三里穴屬于足陽明胃經，曲池穴屬于手陽明大腸經，兩穴均是本經的“合穴”。經氣由此匯聚，進而回合于各自臟腑，正如《靈樞·邪氣藏府病形》一書描述：“滎輸治外經、合治內府”，由此我們認為刺激合穴可促進經氣的通暢，調節(jié)隸屬臟腑之氣，從而使氣血生化充足，經絡得以疏通[13]。故本研究采用針刺曲池穴及足三里穴作為干預手段具有一定的理論依據(jù)。

行為學變化是神經功能的直觀體現(xiàn)，HomecageScan系統(tǒng)較其他行為學檢測手段而言具有明顯的優(yōu)勢，它可實時捕捉及自動化分析大鼠的日常動作，避免了人為觀察導致的干擾因素，更為客觀評價大鼠的行為學變化。我們將各組中大鼠置于HomecageScan系統(tǒng)觀察籠中，結果我們發(fā)現(xiàn)造模大鼠舔毛、行走、后肢站立等動作時間較假手術組明顯長，進食時間明顯縮短，考慮造模后大鼠神經功能缺損嚴重，加上手術創(chuàng)傷，進行上述動作明顯困難，故時間明顯延長，在研究中我們發(fā)現(xiàn)在第7天后2組造模大鼠舔毛、行走、后肢動作逐漸縮短，進食時間延長，我們認為模型組大鼠本身具有較強的自我愈合能力，故隨著時間的延續(xù)大鼠的動作明顯改善，進食時間增加，而干預組改善的情況更加理想，明顯優(yōu)于模型組。我們利用TTC溶液對各組大鼠腦組織切片進行染色，結果發(fā)現(xiàn)接受造模術大鼠腦片組織均出現(xiàn)白色梗死灶區(qū)域。TTC溶液屬于脂溶性光敏感復合物，在脫氫酶的作用下TTC溶液于正常組織結合而出現(xiàn)紅色，而梗死灶因脫氫酶活性下降甚至消失，無法與TTC溶液產生反應而出現(xiàn)白色區(qū)域，研究中我們造模組大鼠腦組織TTC染色出現(xiàn)明顯白色梗死區(qū)域，干預組大鼠梗死區(qū)域明顯小于模型組，這一結果說明了針刺曲池穴及足三里穴可以明顯縮小MCAO模型大鼠的腦梗死體積，從而促進神經功能的恢復。

腦缺血行損傷設計的病理機制復雜，但不論何種病理過程均與細胞凋亡關系密切，依照目前的研究細胞凋亡的前提條件是信號轉導，大量文獻顯示PI3K/AKT信號通路是細胞凋亡的重要信號通路，多數(shù)神經營養(yǎng)因子通過介導PI3K/AKT信號通路抑制神經細胞的凋亡而發(fā)揮治療效果[14-15]。有研究顯示PI3K/AKT在腦缺血事件中發(fā)揮重要作用，AKT是該通路重要調節(jié)因子，但AKT被激活后可作用于其下游的Bax等，從而介導多種生物效應。本研究通過免疫組化及Western blotting手段對PI3K、AKT、p-AKT、Bax因子濃度進行檢測，結果顯示造模后大鼠PI3K降低，Bax升高，針刺足三里穴及曲池穴可上調PI3K及AKT的磷酸化程度，抑制了Bax的表達;并且上調造模大鼠AKT的磷酸化程度。由此說明，針刺曲池穴及足三里穴可通過介導PI3K/AKT信號通路發(fā)揮神經保護效應。

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