膠體金免疫層析法快速檢測乳制品中重金屬離子鉛

趙小旭　柳家鵬　柴艷兵　張耀廣　楊敏　滕燕　李曼　郭健

[摘要]本研究建立了快速檢測乳制品中重金屬離子鉛的膠體金免疫層析試紙條分析方法。通過一系列的實驗，研究了該方法的靈敏度、重復性和特異性，結果表明用免疫膠體金法測定乳制品中生鮮乳和酸奶的檢出限為25～g/kg，成品奶的檢出限為30μg/kg，奶粉和奶酪的檢出限為300μg/kg，方法重現(xiàn)性較好。使用膠體金免疫層析法和原子吸收光譜法同時檢測加標樣品，結果一致。該方法適用于乳制品中重金屬離子鉛的快速檢測。

[關鍵詞]鉛；膠體金免疫層析法；乳制品

中圖分類號：X836 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180308

鉛是對人類健康有巨大毒害作用的金屬元素之一，對人體沒有任何有益的功能。當人體中鉛含量升高時，會破壞血紅蛋白的合成，造成貧血、血壓增高、腎損傷，造成孕婦流產和墮胎，破壞神經中樞，影響腦發(fā)育，影響生育能力，造成小孩發(fā)育遲緩和行為沖動。乳品是一種營養(yǎng)成分齊全，含量高并且易被人體吸收的食品，已成為國民攝取營養(yǎng)物質的主要途徑之一。隨著現(xiàn)代農業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日益加重，隨食物鏈進入動、植物體內，使得乳制品受到污染。

目前常見的重金屬離子的檢測方法主要是石墨爐原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質譜法等，這些方法需要費用高昂的大型儀器設備、專門的實驗室、專業(yè)的操作技術人員和復雜的樣品前處理過程，不適合現(xiàn)場快速篩選檢測。

目前也有采用膠體金免疫層析法檢測重金屬離子鉛，但是主要集中于糧食作物，針對乳制品的研究較少。因此本文基于膠體金免疫層析技術檢測乳制品中重金屬鉛的含量具有必要性，并且對于乳品企業(yè)來說具有實際意義。

1材料與方法

1.1主要儀器

干式加熱器（HMG-GS，北京華安麥科生物技術有限公司）、膠體金讀數(shù)儀（BMZ6000，北京美正生物科技有限公司）、200μL移液器（賽多利斯（上海）貿易有限公司）、計時器（北京華安麥科生物技術有限公司）、離心管（50mL、20mL，潔特）、槍頭（BIOFIL）、一次性手套（麥迪康）、離心機（DM0412，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司）、原子吸收光譜儀（PinAAele900T，perkinelmer公司）、渦旋混合器（TZL-5013，蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司）、分析天平（PL-602E，梅特勒一托利多分析天平）、20目篩網。

1.2主要試劑

三氯甲烷、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、EDTA等。

1.3方法

1.3.1檢測原理

重金屬離子鉛定性檢測試紙條應用了競爭抑制膠體金免疫層析的原理，結構如圖1所示。將金標抗體結合在金標墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于NC膜上，當待測樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標抗體結合，通過層析作用向前移動。當移至T線區(qū)域時，偶聯(lián)抗原和未結合金標抗體結合而被截留，聚集在檢測線（T線）上，剩余金標抗體越過檢測線（T線），在質控線（c線）處與二抗結合顯色。通過可目測的膠體金標記物得到直接的顯色結果或者配合儀器判讀。

1.3.2檢測方法

1.3.2.1樣品前處理

（1）生鮮乳：量取生鮮乳10mL，置于50mL離心管中，加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇，振蕩5min，4 00～min離心5min；移取200μL的PBS溶液（0.01M）和200μL的EDTA（0.5M），置于2mL離心管中，加入40μL上清，振蕩均勻，1min內待檢。

（2）成品奶、奶粉、酸奶、奶酪樣本處理方法。成品奶取樣方法：量取10mL成品奶，置于50mL離心管中；奶粉取樣方法：稱取1g奶粉，置于50mL離心管中，加入9mL純凈水；酸奶取樣方法：稱取10g酸奶，置于50mL離心管中；奶酪取樣方法：奶酪粉碎，稱取1g粉碎的奶酪，置于50mL離心管中，加入9mL純凈水，震蕩3min。按照上述方法取樣后，加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇震蕩5min，4 000r/min離心5min；移取200μL的PBS溶液（0.01M）和200μL的EDTA（0.5M）于2mL離心管中，加入50μL上清，振蕩均勻，1min內待檢。

1.3.2.2檢測步驟

（1）取所需數(shù)量的微孔和試紙條，并做好標記，將微孔置于40%干式加熱器上。

（2）用移液器取200μL待檢樣本加入微孔，并反復吸打，直至紅色固體充分混勻進行孵育，計時5min。

（3）將試紙條立即插入微孔中進行反應，計時5min。

（4）取出試紙條，去除下端樣品墊進行結果判讀，實驗完畢后將試紙條放入盒中密封，2℃～8℃保存。

2結果與分析

2.1結果判定

試紙條檢測結果的判定分為肉眼判定和讀數(shù)儀讀數(shù)判定兩種方式，具體的判定方式可根據(jù)實際情況進行選擇。

2.1.1肉眼判定

膠體金免疫層析法結果判定如圖2所示。當T線和C線同時出現(xiàn)紅色帶時，若T線顏色較C線深或者顏色相同，表示樣品中待檢物質濃度低于檢測限，或不含待檢物質，檢測結果為陰性；若T線顏色較C線淺或T線未顯色，則表示樣品中待檢物質濃度高于檢測限，檢測結果為陽性；若c線未顯色，檢測結果無效，可能是因為操作過程不正確或試紙條已失效。

2.1.2讀數(shù)儀讀數(shù)判定

打開樣品卡殼，將定量試紙條插入樣品卡殼槽內，保證白色NC膜表面的兩條色帶在卡殼視窗中間。將樣品卡殼插入讀數(shù)儀樣品卡槽中，按照儀器操作程序，點擊觸屏“檢測”鍵或“TEST”按鈕，讀取結果。當樣本不含待測物或低于檢測限，檢測結果為陰性；當樣本所含待檢物介于半檢測限和檢測限之間時，檢測結果為疑似陽性；當樣本所含待檢物高于檢測限時檢測結果為陽性。

2.2檢出限實驗

目前市場上乳制品種類繁多，本實驗選取生鮮乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪5類樣品進行檢出限實驗驗證。分別取三個批次的重金屬離子鉛膠體金試紙條進行添加實驗，生鮮乳、成品奶、酸奶的添加量為25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg。奶粉和奶酪的添加量為200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg。上述加標樣品重復6次進行檢測，結果如表1所示。

由表1可知，生鮮乳和酸奶的檢出限為25μg/kg，成品奶的檢出限為30μg/kg，奶粉和奶酪的檢出限為300μg/kg。由于每個乳制品生產加工的工藝不同，所以樣品基質復雜多樣，為了保證實驗的科學、嚴謹和準確性，所以需要對每類產品的檢出限進行評定，以確定相應樣品的檢出限。從表1可以看出，不同批次的試紙條檢測結果存在一定的差異，所以在進行檢出限評定時，選擇3個批次的試紙條進行試驗，保證實驗結果準確。

2.3重復性實驗

選取生鮮乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪分別進行檢測本底樣品、1倍檢出限和2倍檢出限加標樣品，選取3個批次的產品進行檢測，每個樣本使用不同批次的試紙條同時檢測6次，結果如表2所示。

由表2可知，用3個批次的重金屬離子鉛檢測本底樣品時，結果均為陰性，當添加量為1倍檢出限和2倍檢出限時，檢測結果均為陽性。通過檢測結果可知，結果一致，產品重復性好。

2.4穩(wěn)定性實驗

選取上述5類樣品中的一種代表性樣品，分別添加重金屬離子鉛標準品，制成陽性樣品。然后用3個批次的重金屬離子鉛的膠體金試紙條分別平行檢測2次，檢測結果均為陽性，對上述樣品用相同的方法連續(xù)檢測7天，檢測結果均為陽性，說明重金屬離子鉛膠體金試紙條日內、日問的穩(wěn)定性較好，試紙條保存在2℃～8℃，12個月保質期內仍可以特異性檢出陽性，并且靈敏度沒有降低。

2.5特異性實驗

為了檢測重金屬鉛膠體金試紙條對其他重金屬離子的識別能力及檢測特異性，將常見的重金屬離子汞、離子鉻、離子銅、離子鎘添加到上述5類樣品中，與重金屬鉛膠體金免疫層析試紙條做交叉反應。檢測結果顯示，重金屬鉛膠體金試紙條能夠清晰地識別鉛離子，與其他幾種重金屬離子沒有交叉反應，試紙條的特異性良好。

2.6與儀器法對比實驗

膠體金試紙條的檢出限與儀器法的檢出限存在一定的差異，目前我國食品中重金屬的檢測方法大部分企業(yè)采用GB 5009.12-2017《食品安全國家標準食品中鉛的測定》石墨爐原子吸收光譜法（該方法的檢出限為0.02mg/kg，定量限為0.04mg/kg檢測乳制品中的重金屬離子鉛。為比對兩種測定方法，選擇陰性樣品和添加量為0.5mg/kg的陽性樣本進行檢測，這樣能夠有效地保證在標準之下兩種方法均能有效檢出，結果如表3所示。

由表3可知，兩種方法檢測結果一致，表明試紙表3試紙條法和原子吸收光譜法檢測結果對比條可用于生鮮乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪中重金屬離子鉛的快速篩選檢測。

2.7注意事項

為了杜絕檢測過程中一些不適宜因素導致檢測結果出現(xiàn)異常，需要注意以下幾點：（1）不同批次試紙條、微孔、射頻卡均不能混用。（2）產品為一次性消耗品，請在有效期內使用。（3）請勿觸摸試紙條中央白色膜區(qū)。（4）微孔打開時不要用力過猛，以免有粉末飛出，打開后請盡快使用，以免影響檢測結果。（5）所檢測樣本必須為均勻液體，不能有結塊、發(fā)酵、酸敗、沉淀等現(xiàn)象。（6）所有溶液使用前需搖勻，試劑B會有沉淀出現(xiàn)，但不影響結果。（7）溶液移取時請帶保護性手套及口罩進行操作。（8）建議一次檢測數(shù)量不要超過8個，超過8個可分批檢測。（9）檢測時避免陽光直射和電風扇直吹。（10）請勿用自來水、純水及蒸餾水做陰性對照。（11）如發(fā)現(xiàn)陽性，檢測結果需要使用法定的確證方法進行確證。

3結論

通過一系列實驗，重金屬離子鉛膠體金免疫層析試紙條檢測時間在15min內，生鮮乳和酸奶的檢出限為25μg/kg，成品奶的檢出限為30μg/kg，奶粉和奶酪的檢出限為300μg，kg。批間重復性和批內重復性良好，檢測結果與儀器法檢測結果一致。方法簡便，對人員專業(yè)技能要求相對較低，并且其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達到了食品中污染物快速檢測的要求，非常適用于乳品企業(yè)前期的篩選工作。