羚羊角塞特異性PCR鑒別方法研究

蔣超 金艷 袁媛 黃璐琦 趙玉洋

摘要 目的：為解決中藥羚羊角塞與羚羊角相比因失去“通天眼”等傳統(tǒng)鑒別特征而鑒別困難的問(wèn)題，建立準(zhǔn)確鑒別鑒定羚羊角塞的方法。方法：通過(guò)比對(duì)羚羊角塞基原動(dòng)物賽加羚羊與其7種常見(jiàn)混偽品的細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（Cytochrome coxidase I，COI）序列，根據(jù)差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)出僅擴(kuò)增賽加羚羊DNA的特異性鑒別引物。結(jié)果：進(jìn)行PCR時(shí)，當(dāng)退火溫度為64 ℃，循環(huán)數(shù)為33個(gè)時(shí)，僅羚羊角塞正品擴(kuò)增獲得約300 bp大小的條帶，混偽品無(wú)條帶。結(jié)論：該方法可作為準(zhǔn)確有效檢測(cè)待檢樣品是否來(lái)源于賽加羚羊的方法，用于羚羊角類(lèi)樣品的DNA鑒別。

關(guān)鍵詞 特異性PCR；分子鑒定；羚羊角塞；中藥鑒定

Abstract Objective：To solve the problem of authentication difficulty of saigae tataricae cornu tampon due to loss of traditional identify features such as “Tongtianyan”，and to establish an accurate authentication method for saigae tataricae cornu tampon.Methods：Specific PCR primers for S.tatarica were designed based on cytochrome coxidase I （COI） sequences and the annealing temperature of PCR reaction conditions was optimized，which was performed to authenticate saigae tataricae cornu tampon and its 7 adulterants.Results：Only saigae tataricae cornu tampon could obtain a ～300 bp specific band in electrophoresis while the adulterants did not when the temperature was 64 ℃ and 33 cycle number.Conclusion：Specific PCR could accurately and effectively authenticate the biological origin of sample is S.tatarica or not.

Key Words Specific PCR； Molecular authentication； Saigae tataricae cornu tampon； TCM authentication

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.003

中藥羚羊角為牛科動(dòng)物賽加羚羊（Saiga tatarica Linnaeus）的角，角根所具骨質(zhì)結(jié)構(gòu)稱(chēng)羚羊角塞。羚羊角及羚羊角塞均為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有平肝息風(fēng)、清肝明目、散血解毒的功效，臨床效果顯著。

近年來(lái)，由于羚羊角類(lèi)藥材（包括羚羊角、羚羊角塞、羚羊角鎊片等）資源儲(chǔ)量下降，導(dǎo)致常出現(xiàn)偽品混入及跨國(guó)走私等現(xiàn)象。羚羊角塞基原物種賽加羚羊主要分布于我國(guó)及一些中亞國(guó)家，但分布于我國(guó)新疆地區(qū)的賽加羚羊已因過(guò)度捕獵而滅絕，而分布于國(guó)外的種群也因盜獵等原因在短短幾年內(nèi)數(shù)量下降了90%，致使藥用資源嚴(yán)重不足[1-2]。山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）、普氏原羚（Procapra przewalskii）、藏原羚（Procapra picticaudata）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）、蒙原羚（Procapra gutturosa，黃羊）、鵝喉羚（Gazella subgutturosa，長(zhǎng)尾黃羊）等動(dòng)物的角常作為賽加羚羊角類(lèi)的民間代用品[3]，但其療效尤其是退熱效果與正品羚羊角具有明顯差異[4]，不可混用。然而，羚羊角類(lèi)藥材主要為蛋白質(zhì)和骨質(zhì)成分，缺乏用于作為標(biāo)記區(qū)分的小分子次生代謝物，使用顯微鑒別、薄層色譜、蛋白電泳等方法鑒定均有一定困難，大多數(shù)只能區(qū)分羚羊角和山羊角等少數(shù)幾種角類(lèi)，而羚羊角塞因僅剩骨質(zhì)部分，已丟失羚羊角類(lèi)傳統(tǒng)鑒別特征“合把”和“通天眼”，性狀鑒別更為困難。需要建立更加快速、準(zhǔn)確的方法來(lái)鑒定羚羊角塞與其混偽品。

特異性PCR鑒別是一種根據(jù)物種品間差異序列設(shè)計(jì)特異性引物從而專(zhuān)一性鑒別是否為所要求生物基原的DNA分子檢測(cè)方法。該技術(shù)因其客觀、準(zhǔn)確，可為中藥材的鑒定提供準(zhǔn)確的結(jié)果。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載了使用特異性PCR技術(shù)鑒別動(dòng)物類(lèi)藥材蘄蛇、烏梢蛇飲片的方法，成為世界上首個(gè)中藥、天然藥分子鑒定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其準(zhǔn)確性得到了充分驗(yàn)證[5-6]。目前已有多種動(dòng)、植物藥材成功應(yīng)用特異性PCR技術(shù)進(jìn)行基原鑒定，其對(duì)保障藥材市場(chǎng)藥品安全、準(zhǔn)確具有重要的作用[7-11]。雖然目前也有使用特異性PCR方法鑒別羚羊角類(lèi)藥材的報(bào)道，但多只針對(duì)山羊角、黃羊角等2～3個(gè)物種，并未囊括鵝喉羚、水牛角等最為常見(jiàn)的偽品[12-13]。本研究通過(guò)比對(duì)羚羊角塞基原動(dòng)物賽加羚羊及其7種常見(jiàn)混偽品線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（Cytochrome Coxidase I，COI）基因片段序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)僅擴(kuò)增賽加羚羊DNA的特異性鑒別引物，通過(guò)使用試劑盒快速提取DNA，經(jīng)優(yōu)化特異性PCR反應(yīng)程序進(jìn)行快速擴(kuò)增，能準(zhǔn)確鑒別羚羊角塞及其混偽品，為實(shí)現(xiàn)羚羊角類(lèi)藥材的特異性DNA分子鑒別提供技術(shù)保障。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 PCR儀：ABI 9700（Life公司）、VeritiTM（Life公司）、TC-96（杭州博日公司）以及S1000型（Bio-Rad公司）；5810 R型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀（Scientific industries公司）；PowerPacTM型電泳儀（Bio-Rad公司）；HE99X-15-1.5型電泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）。

1.2 試劑 不同特性Taq DNA聚合酶：r Taq（Takara公司生產(chǎn)）、Trans Taq（TransGen公司生產(chǎn)）、Vazyme Taq plus（Vazyme公司生產(chǎn)），中度保真的Ex Taq（Takara公司生產(chǎn)）、HS Taq（Takara公司生產(chǎn)），高度保真的SpeedSTAR HS Taq聚合酶（Takara公司生產(chǎn)）進(jìn)行試驗(yàn)；瓊脂糖（Promega公司生產(chǎn)）；溴化乙啶（Fluka公司生產(chǎn)）；DL2000 DNA Marker（Takara公司生產(chǎn)）；10000×SYBR（Invitrogen公司生產(chǎn)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 分析樣品 采集來(lái)自于不同產(chǎn)地的羚羊角塞正品及常見(jiàn)混偽品共52份材料進(jìn)行特異性PCR鑒別研究。樣品采自安徽亳州、廣西玉林、河北安國(guó)等藥材市場(chǎng)，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

2.1.1 序列比對(duì) 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（National Center for Biotechnology Information）中下載羚羊角塞的基原物種賽加羚羊（KF73209.1、KC679014.1、KC679010.1）及其可能的混偽品基原物種綿羊（KT750038.1）、山羊（JN245994.1）、普氏原羚（KC679051.1）、藏原羚（KC679009.1）、藏羚羊（HQ269460.1）、蒙原羚（KC679036.1）、鵝喉羚（KC679026.1）的COI序列經(jīng)Clustal W程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，選擇羚羊角塞基原動(dòng)物與其混偽品序列差異大的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

2.1.2 引物設(shè)計(jì) 使用Premier Primer 5.0（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/）設(shè)計(jì)特異性PCR鑒別引物，調(diào)整參數(shù)使引物為3′末端位于賽加羚羊與其混偽品序列差異區(qū)域，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～400 bp，Tm值為55～65 ℃。引物命名為L(zhǎng)YJ.F和LYJ.R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.2 基因組總DNA的提取 取2 g樣品，用70%乙醇擦拭表明，使用Retsch MM 400球磨儀粉碎至能過(guò)80目篩，取50 mg粉末，使用Wizard SV Genomic DNA Purification System（Promega公司）試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。

2.3 PCR擴(kuò)增條件的確定 通過(guò)調(diào)整PCR體系和反應(yīng)程序確定蛤蚧特異性鑒別的最優(yōu)條件。25 μL初始PCR反應(yīng)體系在200 μL離心管中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L each）1.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL和模板1 μL，加入羚羊角塞正反向鑒別引物（10 μmol/L）各0.2 μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)在VeritiTM型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。初始反應(yīng)程序。見(jiàn)表2。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入5 μL 6×Loading buffer（Takara公司）混勻后于GelRed染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

使用羚羊角塞鑒別引物對(duì)羚羊角正品及其常見(jiàn)偽品總DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，并分別考察：1）退火溫度；2）PCR循環(huán)數(shù)；3）模板DNA濃度；4）變性和退火時(shí)間；5）Taq種類(lèi)；6）不同PCR儀對(duì)PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。

2.4 羚羊角塞特異性鑒別引物的設(shè)計(jì) 使用ClustalW軟件對(duì)賽加羚羊、山羊、綿羊、普氏原羚、藏原羚、藏羚羊、蒙原羚、鵝喉羚的COI序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，以賽加羚羊與混偽品具有差異的SNP位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，賽加羚羊預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為266 bp，如圖1。

2.5 羚羊角塞特異性PCR鑒別條件考察 由于影響特異性鑒別準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素包括退火溫度、循環(huán)數(shù)和模板DNA濃度，而決定PCR反應(yīng)速度的核心因素為循環(huán)數(shù)和退火/延伸時(shí)長(zhǎng)，本研究以正品擴(kuò)增強(qiáng)度和偽品條帶有無(wú)為指標(biāo)，依次對(duì)退火溫度、循環(huán)數(shù)、DNA濃度、變性/退火時(shí)間進(jìn)行了系統(tǒng)考察，同時(shí)考察篩選的條件對(duì)不同Taq DNA聚合酶及不同PCR擴(kuò)增儀的耐受性，結(jié)果表明，退火溫度位于60～66 ℃，循環(huán)數(shù)27～33，DNA模板濃度1～25 ng/μL羚羊角及其常見(jiàn)混偽品。見(jiàn)表3。在此條件下對(duì)不同保真度的Taq酶和不同型號(hào)PCR儀均具有耐受性。見(jiàn)表3。而退火溫度過(guò)低（<60 ℃）、循環(huán)數(shù)過(guò)大（>33）則會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，模板濃度過(guò)低（<1 ng/μL）則會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。最終確定羚羊角特異性PCR鑒別反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)33次（95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s）72 ℃延伸5 min。

2.6 適用性考察 使用羚羊角塞特異性鑒別引物，采用篩選出的擴(kuò)增體系和PCR反應(yīng)條件，對(duì)不同藥材市場(chǎng)的31批羚羊角類(lèi)樣品（其中羚羊角塞20批，羚羊角11批）及混偽品21批進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，僅羚羊角和羚羊角塞正品在200～300 bp間產(chǎn)生明亮單一條帶，偽品無(wú)條帶。見(jiàn)圖2、圖3。不同來(lái)源的正品羚羊角塞均產(chǎn)生一致結(jié)果，表明該體系能穩(wěn)定準(zhǔn)確地鑒別羚羊角塞。

3 討論

遺傳間斷是進(jìn)行物種劃分的基礎(chǔ)，DNA分子鑒定的前提條件是正品與混偽品間存在序列差異，本研究對(duì)正品羚羊角塞的基原物種賽加羚羊及外觀形態(tài)相似的7種混偽品物種COI序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)正偽品序列存在顯著差異，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析亦呈單系[14-15]，故而可從根據(jù)COI序列差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行鑒別。

進(jìn)行PCR分子鑒別的第一步是DNA提取，不同的方法其DNA提取效果可能會(huì)有區(qū)別，同時(shí)因羚羊角塞為骨制品，DNA提取較為困難。為保證鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究試驗(yàn)了不同的DNA提取方法（Promega DNA提取試劑盒，柱式骨骼DNA提取試劑盒，SDS法和CTAB法），發(fā)現(xiàn)各方法均能獲得良好的提取效果，光吸收比值A(chǔ)260/A280>1.5，濃度均>20 ng/μL，且均可滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增的基本要求。本研究選擇最為簡(jiǎn)便的Promega DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。方法學(xué)考察是獲得穩(wěn)定、準(zhǔn)確DNA分子鑒別方法的必要步驟[16]。我們對(duì)影響PCR擴(kuò)增的核心因素，如退火溫度、PCR循環(huán)次數(shù)、DNA濃度、DNA聚合酶用量及不同品牌的PCR儀和DNA聚合酶進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)所建立的特異性PCR鑒別方法具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。見(jiàn)表3。為考察羚羊角塞特異性PCR鑒別方法的特異性和適用性，本研究收集了不同藥材市場(chǎng)的31批羚羊角塞類(lèi)正品和市場(chǎng)常見(jiàn)的21批羚羊角塞混偽品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果僅正品能擴(kuò)增獲得約300 bp大小的條帶，混偽品無(wú)條帶，表明所建立的特異性PCR鑒別方法能專(zhuān)屬性鑒別待檢樣品是否為正品基原，對(duì)羚羊角塞藥材的使用和流通的安全性與規(guī)范性起到保障作用。

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