丹參植株原位侵染RNAi毛狀根體系的建立及其干擾效果

毛亞平 馬瑩 卜俊玲 曾雯 郭娟 陳敏 黃璐琦

摘要 目的：利用土培植物進行原位侵染獲得RNAi型丹參毛狀根，并對其干擾效果進行研究。方法：利用轉化有目標基因RNAi載體的發根農桿菌對土壤中生長的丹參幼苗根莖部分進行侵染產生毛狀根，經熒光顯微鏡鑒定陽性毛狀根，并利用實時熒光定量PCR檢測目標基因的表達情況。結果：在土培丹參根莖部分成功侵染產生毛狀根，利用熒光顯微鏡進行檢測顯示目標基因RNAi型毛狀根陽性轉化率為72.72%，RNAi空載毛狀根陽性轉化率為66.67%。實時熒光定量PCR結果表明RNAi型毛狀根中目標基因表達受到抑制，表達量下降到空載型對照組的8.61%，證明對土培植物直接進行侵染能夠成功誘導RNAi毛狀根。結論：采用原位侵染法誘導丹參根莖部位成功產生陽性RNAi型毛狀根，侵染過程無需無菌操作，簡單快捷，對植株生長無影響，能夠用于功能基因的體內功能研究。

關鍵詞 丹參；毛狀根；原位侵染；RNAi

Abstract Objective：To study the jamming effects of RNAi hairy roots of Salvia Miltiorrhiza by in situ infection of soil cultivating plants.Methods：Hairy roots were induced by infection of Agrobacterium rhizogenes transformed with the RNAi vector of target gene into the roots of Salvia Miltiorrhiza which were planted in the soil.Positive hairy roots were identified by fluorescence microscope.The expression of target gene was detected by qRT-PCR analysis.Results：Hairy roots were induced from the roots of Salvia Miltiorrhiza successfully.GFP detection results showed that positive conversion rates of hairy root lines of target gene RNAi and empty vector were 72.72% and 66.7%，respectively.qRT-PCR analysis revealed that the expression of target gene in RNAi hairy roots was significantly decreased to 8.61% compared with empty vector，which indicated that RNAi hairy roots were successfully induced from the soil planted Salvia Miltiorrhiza by in situ infection.Conclusion：Positive target gene-RNAi Salvia Miltiorrhiza hairy roots were successfully induced from the soil planted Salvia Miltiorrhiza by in situ infection.As the infection required no sterile operation，it was not only simple and quick，but also would not affect plant growth and development.It can be applicable to functional characterization of gene in vivo.

Key Words Salvia Miltiorrhiza； Hairy root； In situ infection； RNAi

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.004

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge.）的干燥根及根莖，丹參中脂溶性的丹參酮類化合物（Tanshinones）具有抗血栓、抗肝纖維化、抗炎、抗菌以及抗腫瘤等生物活性[1-3]。解析丹參酮生物合成途徑，并利用代謝工程的手段來調節丹參酮的含量對中藥資源的可持續利用和發展具有重大的意義。

藥用植物活性成分生物合成途徑解析成為近5年中藥研究的熱點領域之一，對候選基因進行功能研究是生物合成途徑解析的關鍵。基因功能研究包括體外功能研究和體內功能研究，體外酶促反應是植物基因驗證功能的重要手段之一，具有快捷、方便的優點，但體外酶促反應會受到底物不明確，底物量不足等因素限制。植物具有極其復雜的代謝網絡導致其次生代謝物的積累會受到眾多因素的影響，如催化合成產物的功能基因，代謝途徑的轉錄因子，中間產物轉運酶和植物自身受到來自外界化學和生物刺激等，都會影響代謝產物的合成和積累。因此，為了更加明確基因在植物代謝網絡中發揮的功能和作用，其催化功能在植物體外由原核、真核表達及體外酶促等手段經過驗證后還需要在植物體內對基因的功能進行研究。

利用葉盤法產生RNAi（RNA Interference）毛狀根是藥用植物基因功能研究的重要方法之一，該方法主要利用轉化有目標基因RNAi載體的發根農桿菌侵染外植體，產生RNAi型毛狀根。該系統具有生長速度快，周期短，穩定遺傳，不需要外源植物激素等優點，是基因體內驗證研究的常用方法。Cheng等[4]利用該技術對丹參酮生物合成途徑的萜類合酶基因SmCPS進行干擾后發現丹參酮IIA等有效成分的含量顯著降低。Ma等[5]構建了丹參CYP76AH1的RNAi毛狀根體系，CYP76AH1-RNAi型毛狀根系中底物次丹參酮二烯含量的顯著上升和產物鐵銹醇含量的顯著下降揭示了CYP76AH1在丹參植物體內的催化功能，下游途徑中4個主要丹參酮類化合物含量的顯著下降驗證了CYP76AH1在丹參酮類化合物生物合成途徑中的關鍵作用。研究表明，利用葉盤法進行RNAi毛狀根誘導能夠有效抑制目標基因的表達，導致代謝產物發生變化，從而驗證基因在植物體內的功能。

然而葉盤法誘導需要經歷預培養、共培養、選擇培養、愈傷形成等過程，誘導周期長并且毛狀根的遺傳轉化需要在無菌的環境中進行，具有一定的風險。而對土培植物直接進行侵染誘導出毛狀根相比之下更為簡便，通過在組織上劃出傷口，將發根農桿菌直接接種在傷口處，共培養一段時間后，在植株接種部位能夠誘導產生毛狀根。該方法已經成功應用在烏拉爾甘草和桑樹等藥用植物研究中[6-7]。本研究擬在重要藥用植物丹參中建立原位毛狀根侵染誘導體系，以丹參酮生物合成途徑重要修飾酶基因CYP76AH1為目的基因[8]，構建RNAi載體，轉化發根農桿菌，侵染土培丹參植株的根莖部位，得到既含有丹參自身主根、須根，又含有目的基因RNAi片段轉基因毛狀根的復合型丹參植株，利用綠色熒光蛋白篩選轉化毛狀根以用于基因表達和代謝物譜分析。通過建立丹參毛狀根的原位侵染誘導的方法，為丹參酮下游基因功能研究提供新方法。

1 材料

1.1 藥物 植物材料唇形科鼠尾草屬植物紫花丹參（Salvia miltiorrhiza）。實驗材料為發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）誘導此丹參生成的毛狀根。菌株和載體發根農桿菌C58C1為本實驗室保存菌種，植物RNAi表達載體pK7WIWG2D為本實驗室保存載體，pK7GWIWG2D-AH1為實驗室前期構建載體[5]。

1.2 試劑與儀器 PrimeScriptTM-RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），SYBRPremix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（由大連寶生物工程有限公司生產）；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司生產）；所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司生產合成。實驗儀器LightCycler 480II高通量實時熒光定量PCR系統（Roche Applied Science）；680X凝膠成像分析系統（基因有限公司）；Axio Scope A1熒光顯微鏡（Zeiss）。

1.3 方法

1.3.1 土培丹參原位毛狀根誘導 取播種后40～60 d的丹參幼苗，利用注射器針頭在主根上部和根莖處輕劃形成傷口，用注射器分別吸取含有野生型發根農桿菌、轉化有RNAi空載體pK7WIWG2D和pK7GWIWG2D-AH1表達載體的發根農桿菌菌液侵染損傷部位后浸潤1～2 h[9]，在損傷部位周圍放置1層大小足以覆蓋至花盆邊緣的錫箔紙，防止毛狀根與丹參自身主根、須根混雜，在錫箔紙上方蓋好土壤，進行毛狀根誘導和培養。

1.3.2 毛狀根熒光顯微鑒定 將傷口處長出的毛狀根尖切下1 cm左右大小制片后，于倒置熒光顯微鏡藍色激發光源下觀察，按照公式計算轉化率。

1.3.3 測定干擾毛狀根基因表達量 利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取丹參毛狀根總RNA。NANO Drop核酸定量儀測定RNA濃度后，反轉錄成總cDNA。利用軟件Primer 5.0設計qRT-PCR引物，以cDNA為模板，以野生型、空載型為對照，利用實時熒光定量PCR檢測RNAi毛狀根中CYP76AH1基因的相對表達量。見表1。

2 結果

2.1 CYP76AH1-RNAi型毛狀根產生 前期研究表明，pK7GWIWG2D-AH1載體能夠成功抑制RNAi毛狀根中CYP76AH1的表達，并對代謝產物的積累產生影響[5]。本研究中利用轉化有pK7GWIWG2D-AH1載體的發根農桿菌直接侵染土培丹參的根以及根莖部位，經過誘導培養，約15 d后在主根上部和根莖傷口處生長出透明毛狀根，植株被侵染過后其生長并沒有受到影響。毛狀根在主根上部和根莖傷口部位發出，主要在錫箔紙的上層貼近生長，約30 d后即獲得大量的CYP76AH1-RNAi型毛狀根。見圖1。

2.2 毛狀根誘導率檢測 取被侵染丹參的錫箔紙以上部分的毛狀根于倒置熒光顯微鏡下檢測，可以觀察到轉化RNAi空載體（圖2A，2B）與目的基因CYP76AH1干擾載體（圖2C，2D）的丹參毛狀根在藍色（450～490 nm）激發光下會發射出穩定的綠色熒光（520 nm），而利用野生型發根農桿菌C58C1侵染產生的毛狀根（圖2E，2F）僅在自然光下可見，在藍色激發光下無熒光。通過GFP檢測對其陽性轉化率進行統計以及計算，顯示CYP76AH1-RNAi型毛狀根陽性轉化率為72.72%，空載型毛狀根陽性轉化率為66.67%。

2.3 CYP76AH1-RNAi型毛狀根基因表達量檢測 選擇生長狀況大致相同的丹參野生型、空載型和CYP76AH1-RNAi型毛狀根提取總RNA，反轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR分析。見圖3。

對實時熒光定量PCR結果進行歸一化處理后進行差異顯著性分析，分析結果顯示野生型和空載型毛狀根之間沒有顯著性差異，CYP76AH1-RNAi型毛狀根中目標基因CYP76AH1表達量顯著下降至空載型毛狀根的8.61%，證明原位侵染法誘導丹參毛狀根體系構建成功，其干擾效果明顯。見圖4。

3 討論

RNAi技術通過抑制目的基因的表達，導致代謝物積累發生改變，從而驗證目的基因在植物復雜代謝網絡中的作用。在本研究中利用原位侵染法以發根農桿菌侵染土培丹參植株產生毛狀根，以丹參酮生物合成途徑中第一個P450基因CYP76AH1為目的基因進行方法研究。實時熒光定量PCR分析結果顯示，CYP76AH1-RNAi型丹參毛狀根中CYP76AH1基因表達量顯著低于野生型、空載型毛狀根，說明該體系對目標基因具有較好的干擾效果，可以用于丹參酮生物合成途徑其他基因的功能研究。

目前發根農桿菌介導的轉化方法有3種。外植體接種法嚴格要求無菌環境且耗時較長，原生質體共培養法則要求原生質體具有較高的再生率，植物體原位侵染法最為省時簡便[10]。在土培植物上采用原位侵染法誘導產生毛狀根，在植株自身生長的自然環境下即可利用發根農桿菌進行侵染操作，不要求嚴格的無菌環境下，侵染過后植株生長情況正常，1個月左右便能產生足夠的毛狀根用于基因表達和代謝物分析，誘導產生的毛狀根具有較高的陽性轉化率并且能有效地對目標基因進行干擾。整個體系建立的過程省時、簡單且便于操作、侵染過程無需無菌操作，極大地提高了實驗效率。基于以上優點，直接侵染法作為一種構建RNAi型毛狀根體系的有效方法，可應用到根系藥用植物例如人參、三七等植物次生代謝產物生物合成途徑功能基因的挖掘和功能研究中。

參考文獻

[1]Husna B，On T，Zhu YZ.Effects of purified Salvia miltiorrhiza extract on cardiac vascular smooth muscle hypoxic cells[J].J Pharmacol Sci，2007，104（3）：202-211.

[2]Gao HW，Sun W，Zhao JP，et al.Tanshinones and diethyl blechnics with anti-inflammatory and anti-cancer activitiesfrom Salvia miltiorrhiza Bunge（Danshen）[J].Sci Rep，2016（6）：33720.

[3]Parajuli D R，Zhao Y Z，Jin H，et al.Anti-fibrotic effect of PF2401-SF，a standardized fraction of Salvia miltiorrhiza，in thioacetamide-induced experimental rats liver fibrosis[J].Arch Pharm Res，2015，38（4）：549-555.

[4]Cheng Q，Su P，Hu Y，et al.RNA interference-mediated repression of SmCPS（copalyldiphosphate synthase）expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS[J].Biotechnol Lett，2014，36（2）：363-369.

[5]Ma Y，Ma XH，Meng FY，et al.RNA interference targeting CYP76AH1 in hairy roots of Salvia miltiorrhiza reveals its key role in the biosynthetic pathway of tanshinones[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，477（2）：155-160.

[6]郭生虎，王敬東，馬洪愛.烏拉爾甘草毛狀根的誘導及培養體系的建立[J].西北農業學報，2012，21（12）：138-141.

[7]孔衛青，楊金宏，盧從德.發根農桿菌誘導桑樹毛狀根體系的建立[J].西北植物學報，2010，30（11）：2317-2320.

[8]Guo J，Zhou Y J，Hillwig M L，et al.CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（29）：12108-12113.

[9]Hatlestad GJ，Sunnadeniya RM，Akhavan NA，et al.The beet R locus encodes a new cytochrome P450 required for red betalain production[J].Nat Genet，2012，44（7）：816-820.

[10]胡亞忱，曲德業.發根農桿菌誘導植物毛狀根的發生及次生代謝物生產的研究進展[J].吉林師范大學學報：自然科學版，2005，26（1）：31-32，35.