丹紅注射液對急性心肌梗死模型大鼠炎癥反應和心肌形態學的影響

施洋 候寶林 樊登峰 樊官偉

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2602-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.03

摘 要 目的：研究丹紅注射液（DHI）對急性心肌梗死（簡稱“心梗”）模型大鼠心肌保護的作用機制。方法：將30只大鼠按照隨機數字表法分成假手術組（生理鹽水，肌內注射）、模型組（生理鹽水，肌內注射）和DHI組（0.76 mL/kg，肌內注射），每組10只。除假手術組外，其余各組大鼠均采用左冠狀動脈前降支結扎法復制心梗模型。造模成功后，各組大鼠每天給藥1次，連續給藥14 d。在術后24、48 h，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平；給藥14 d后，采用酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠血清中白細胞介素1β（IL-1β）、C反應蛋白（CRP）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，采用超聲儀觀察各組大鼠左心室室壁運動變化情況，并結合蘇木精-伊紅染色及MASSON染色進行心肌形態學分析。結果：與假手術組比較，模型組大鼠在術后24 h血清中LDH、CK、CK-MB水平顯著升高（P<0.05）；給藥14 d后血清中IL-1β、CRP、TNF-α水平顯著升高（P<0.05），左心室前壁幾乎無波動，且心肌組織中僅有少量心肌細胞存活，出現細胞體積增大、排列松散，細胞核固縮或溶解等變化，心梗面積百分比顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，DHI組大鼠在術后48 h血清中LDH、CK、CK-MB水平顯著降低（P<0.05）；給藥14 d后血清中IL-1β、CRP、TNF-α水平顯著降低（P<0.05），左心室擴張程度明顯減輕，心室壁增厚且出現波動，心肌纖維化程度降低，心肌細胞壞死數量減少，心梗面積百分比顯著降低（P<0.05）。結論：DHI可通過降低心肌酶譜和炎癥因子水平抑制心肌纖維化，從而改善心梗。

關鍵詞 丹紅注射液；心肌梗死模型；心肌酶譜；炎癥因子；形態學分析；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Danhong injection （DHI） on myocardial protection of acute myocardial infarction （AMI） model rats. METHODS： Totally 30 rats were randomly divided into sham operation group （normal saline， im）， model group （normal saline， im） and DHI group （0.76 mL/kg， im） according to random number table method， with 10 rats in each group. Except for sham operation group， AMI model was induced by ligation of left anterior descending coronary artery in other groups. After modeling， rats were given relevant medicine once a day， for consecutive 14 d. 24， 48 h after operation， the serum lsevels of LDH， CK and CK-MB were determined by automatic biochemical analyzer. 14 d after medication， the serum levels of IL-1β， CRP and TNF-α were determined by ELISA. Echocardiography was applied to observe the changes of left ventricular wall movement of rats in each group. Based on HE staining and MASSON staining， morphological analysis was performed for myocardial. RESULTS： Compared with sham operation group， the serum levels of LDH， CK and CK-MB in model group were increased significantly 24 h after operation （P<0.05）. 14 d after medication， the serum levels of IL-1β， CRP and TNF-α were increased significantly （P<0.05）； there was almost no fluctuation in the anterior wall of the left ventricle； in the myocardial tissue， only a small number of myocardial cells survived， while cell volume increased and arranged loosely； nuclear condensation or dissolution were also found； the percentage of myocardial infarction area was increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the serum levels of LDH， CK and CK-MB in DHI group were decreased significantly 48 h after operation （P<0.05）. Serum levels of IL-1β， CRP and TNF-α were decreased significantly 14 d after medication （P<0.05）. The degree of left ventricle dilation decreased significantly， and ventricular wall thickened and fluctuated； myocardial fibrosis decreased， necrosis of myocardial cells decreased， and the percentage of myocardial infarction area decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： DHI plays the role of improvement of AMI by decreasing the levels of myocardial enzyme spectrum indexes and inflammatory factors and inhibiting myocardial fibrosis.

KEYWORDS Danhong injection； Acute myocardial infarction model； Myocardial enzyme spectrum； Inflammatory factors； Morphological analysis； Rat

急性心肌梗死（簡稱“心梗”）是指在冠狀動脈病變的基礎上，由于冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧，血液供應中斷，使心肌出現嚴重而持久的急性缺血，最終導致心肌發生的缺血性壞死[1]。截至2015年，全世界范圍內1/3的死因是急性心血管疾病，這其中死于心梗的比例又占到半數以上[2]。心梗具有較高的發病率，嚴重危害人類健康，提高心梗的防治水平，降低患者的病死率，已成為當今醫學研究的重大課題之一[3]。

丹紅注射液（DHI）是以中醫理論為指導，采用現代制藥工藝對丹參、紅花進行提取后制成的中藥注射劑，主要成分有丹參水溶性成分丹參酸、丹參酚酸及紅花水溶性成分紅花黃色素、紅花酚苷和兒茶酚等，具有活血化瘀、通脈舒絡等功效，臨床上廣泛用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風、冠心病、心絞痛、心梗等的治療[4]。現代藥理學研究表明，DHI具有心肌保護、抗炎、抗凝抑栓、抗凋亡等作用[5]。炎癥反應在心梗的發展過程中占據重要地位，且與心梗的預后緊密相關。心肌損傷后，機體釋放多種炎癥因子并引起炎癥反應，從而對心肌造成進一步損害。減輕炎癥反應導致的心肌損害，保護心肌細胞結構完整，是心梗后治療的常規手段。基于此，本研究旨在研究DHI對心梗模型大鼠血清中炎癥因子水平的影響，利用超聲儀觀察左心室壁運動變化情況，并結合形態學分析，評估DHI對心臟的保護作用，進而為其臨床應用及闡明其更多的作用機制提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

MP-150型多導生理記錄儀（美國Biopac公司）；Microlab 300型全自動生化分析儀（荷蘭威圖科學公司）；ALC-V8型小動物呼吸機（上海精密科學儀器有限公司）；STEMI2000-C型體視顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；VS4153型超聲系統氣體麻醉裝置、Vevo2100型小動物超聲儀（加拿大Visual Sonics公司）；DP71型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Microfuge22R型冷凍離心機（美國Beckman公司）。

1.2 藥品與試劑

DHI（菏澤步長制藥有限公司，批號：17121030，規格：10 mL/支）；注射用青霉素鈉（石家莊制藥基團有限公司，批號：017140617，規格：0.96 g/瓶）；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、白細胞介素1β（IL-1β）、C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A020-1、A032、H197、H002、H126、H052）；伊紅染色液、蘇木精染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1100、H8070）；MASSON三染試劑盒（美國Sigma公司，批號：HT15-1KT）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠30只，♂，體質量220～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[實驗動物生產合格證號：SCXK（京）2014-0008]。購入后大鼠飼養于天津中醫藥大學醫學動物實驗中心清潔級動物房中，控制飼養房內溫度為20～25 ℃、相對濕度為40%～60%、明暗環境各12 h交替。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將30只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組和DHI組，每組10只。模型組和DHI組大鼠采用左冠狀動脈前降支結扎法復制心梗模型，具體操作如下：將模型組和DHI組大鼠麻醉后頸部及胸前備皮，仰臥位固定于手術臺中央，碘伏消毒備皮區皮膚。沿頸部正中切開皮膚，避開甲狀腺，鈍性分離肌肉，不銹鋼鉤牽拉暴露氣管。用靜脈鞘管針帶芯經口插入氣管，拔出針芯，連接呼吸機設定參數（呼吸頻率80次/min，潮氣量4 mL，呼-吸比為1 ∶ 1）后進行輔助呼吸。將多導生理記錄儀的電極分別插入大鼠右上（負極）及左下肢（正極），記錄標準Ⅱ導聯心電圖。于大鼠左胸第三、四肋間隙作一斜行切口約1.5 cm，止血鉗逐層分離皮下肌肉組織后撐開胸腔，并用牽拉鉤牽拉，暴露心臟。在體視顯微鏡視野下，剝離心包膜，持6/0無創縫合針絲線，于肺動脈圓錐與左心耳交界，距離冠狀動脈起始點下方1～2 mm處進針，深度1.0～1.5 mm進行結扎（結扎后心電圖表現為S-T段弓背向上抬高，T波高聳，QRS波電壓增高伴波幅增寬即判定為造模成功[6]）。結扎力度適中，避免力量過大導致血管及心肌斷裂。結扎完畢后，立即用干燥棉簽清理胸腔，擠出胸腔內殘余氣體，并用3/0縫合線逐層縫合肌肉及皮膚，切口處進行局部消毒。觀察1 min后將大鼠放置在恒溫電熱毯上，待大鼠恢復自主呼吸后，拔出氣管插管。假手術組大鼠只穿線不結扎，其余處理同上。術后連續3 d腹腔注射青霉素鈉（40萬U/只）預防感染，并同時給予相應藥物，DHI組大鼠肌內注射DHI（0.76 mL/kg，根據臨床用量換算而得的等效劑量），假手術組和模型組大鼠肌內注射生理鹽水（0.76 mL/kg），每天給藥1次，連續給藥14 d。由于模型組大鼠在術后有2只死亡，故最終每組選8只大鼠進行結果分析。

2.2 血清心肌酶譜及炎癥指標測定

大鼠行冠狀結扎術后24、48 h，眼內眥取血，將血樣置于37 ℃恒溫水浴中靜置2 h，然后以3 500 r/min離心10 min，吸取上清液至EP管中，應用全自動生化分析儀按照試劑盒操作說明對心肌酶譜LDH、CK、CK-MB水平進行檢測。給藥14 d后，處死并抽取腹主動脈血，按上述操作制備血清，然后按照相應試劑盒說明書方法對血清中炎癥因子（IL-1β、CRP和TNF-α）水平進行檢測。

2.3 左心室室壁運動變化情況評價

連續給藥14 d后進行左心室室壁運動的變化情況評價。以異氟烷麻醉（完全麻醉：1%氧氣+5%異氟烷于麻醉盒內吸入麻醉；持續麻醉：1%氧氣+2%異氟烷吸入麻醉）后，對大鼠進行心臟超聲評價。取M-型超聲長軸切面，獲得M-型超聲圖像，將取樣線定位至左心室最大腔徑處，觀察左室前壁、后壁厚度及左心室室壁運動變化情況。

2.4 大鼠心肌形態學觀察

將各組大鼠的心臟于4%多聚甲醛溶液中固定，在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取3 mm厚度心臟組織塊，常規進行脫水、透明、石蠟包埋后制作4 μm切片，經過攤片、烘片、58 ℃烤片后室溫放置過夜，待自然干燥完畢后進行蘇木精-伊紅（HE）染色和MASSON染色，在倒置光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌形態學變化。取MASSON染色后心臟全景拍攝照片，觀察梗死范圍并計算心梗面積百分比（以梗死心肌占缺血心肌面積百分比表示），應用Image J軟件對梗死范圍進行統計。

2.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則采用Dunnetts T3法；術后和術前的組間比較采用配對t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 術后24、48 h大鼠血清中心肌酶譜指標測定結果

術后24 h，模型組和DHI組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平較術前均顯著升高（P<0.05）；由于開胸和假手術操作（只穿線，不結扎）對肌肉及心肌會造成輕微損傷，故假手術組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平較造模前也顯著升高（P<0.05）。術后48 h，DHI組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平較模型組同期顯著降低（P<0.05）。各組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平測定結果見表1。

3.2 給藥14 d后大鼠血清中炎癥因子水平測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、CRP和TNF-α水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，DHI組大鼠血清中IL-1β、CRP和TNF-α水平顯著降低（P<0.05）。各組大鼠血清中炎癥因子水平測定結果見表2。

3.3 給藥14 d后大鼠左心室室壁變化情況觀察結果

與假手術組比較，模型組大鼠左心室腔呈現出進行性擴張，且擴張程度明顯；左心室前壁變薄，幾乎無波動現象。與模型組比較，DHI組大鼠左心室腔擴張程度顯著減輕，心室壁增厚且呈現出波動現象，結果見圖1。

3.4 給藥14 d后大鼠心肌形態學觀察結果

3.4.1 HE染色結果 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞排列整齊、致密，結構完整、清晰，細胞間隙均勻，細胞外基質少。與假手術組比較，模型組大鼠僅見少量存活心肌細胞，存活心肌細胞體積增大，且排列松散、凌亂，細胞核固縮或溶解，細胞間隙增寬，心肌橫紋斷裂、消失。DHI組大鼠心肌病變程度較模型組顯著減輕，殘存心肌細胞呈“島嶼狀”分布。各組大鼠心肌HE染色結果見圖2。

3.4.2 MASSON染色結果 MASSON染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織呈紅色，組織排列整齊，視野中無膠原纖維出現。造模后，各組大鼠心肌組織梗死邊緣區均發生纖維化改變，出現瘢痕，其中以模型組大鼠最為嚴重。此外，模型組大鼠殘存心肌組織較少，心肌細胞分布不均，結構破壞嚴重。與模型組比較，DHI組大鼠心肌纖維化程度減輕，膠原纖維面積明顯減小，殘存心肌細胞周圍有眾多新生血管分布。各組大鼠心肌MASSON染色結果見圖3。

對MASSON染色心臟全景拍片后，發現模型組大鼠左心室壁明顯變薄，纖維化程度嚴重，心室腔較假手術組顯著擴張。DHI組大鼠殘存心肌組織多，室壁梗死面積面積較小，心室腔縮小，梗死區與正常心肌組織交界處分界模糊。應用Image J軟件分析發現，模型組大鼠心梗面積百分比較假手術組顯著升高（P<0.05），DHI組大鼠心梗面積百分比較模型組顯著降低（P<0.05）。各組大鼠心肌MASSON染色全景圖見圖4，心肌梗死面積百分比統計結果見圖5。

4 討論

心血管疾病作為一種現代流行病，是當今危害人類身體健康最為嚴重的疾病，其發病率、病死率遠超其他重大疾病，位居各類疾病之首[7]。心梗是心血管疾病的首要死因，我國心梗的發病率雖低于發達國家，但隨著社會經濟的發展及生活方式的改變，其發病率呈現逐年增長的趨勢[8]。心梗急性期心功能受到嚴重影響，易發生心室重構，致心功能不全，最終導致死亡。因此，早期應用臨床手段減少心梗后的心肌損傷及機體反應，可有效改善心功能，提升患者的生存質量。

心臟超聲檢測在心梗診斷中扮演著重要的角色，目前已成為臨床上觀察心臟運動及評估心功能狀況的常規手段[9]。在本研究中，從M-型心動超聲圖可明顯看出，模型組大鼠心梗后左心室室壁運動大幅減弱，在造模14 d后幾乎看不見左心室前壁波動情況。而連續給予DHI 14 d后，發現該情況得到了顯著改善，大鼠左心室室壁波動逐漸得到恢復，這表明DHI可有效增強心臟收縮，改善心臟泵血功能。

心梗后，心肌細胞膜通透性增加，心肌細胞中LDH、CK、CK-MB大量釋放入血，使得其在血液中含量急劇上升[10]。CK-MB作為傳統的心肌標志物，在臨床上用于診斷心梗，其與LDH、CK等共同組成心肌酶譜，對于早期心肌損傷及梗死的判別有著重要作用[11]。在本研究中，各組大鼠給藥術后24 h血清中的LDH、CK、CK-MB水平較造模前均顯著升高，這是由于開胸及穿針操作不可避免地會對心肌造成輕微損傷，故各種類型的心臟手術都會引起血清中LDH、CK、CK-MB等心肌酶水平的升高，且心梗發生后其水平在12～36 h達峰[12]。而DHI可以顯著降心梗模型大鼠術后48 h血清中的LDH、CK、CK-MB水平，表明DHI具有減輕心肌損傷，延緩心肌壞死，降低機體不良應激反應的作用。

心梗的發生發展與許多炎癥因子（如IL-1β、CRP和TNF-α等）高度相關[13-15]。其中，TNF-α是一種自分泌的炎癥因子，參與了心梗過程中心肌損傷的形成和發展。當心梗發生時，TNF-α表達水平升高，促進白細胞與內皮細胞的黏附和相互作用，使粒細胞向缺血區域的浸潤大大增加，從而導致心肌損害[16]。此外，TNF-α作為炎癥反應的啟動因子，能促進內皮細胞黏附白細胞，刺激內皮細胞分泌炎性介質，增加炎性介質滲出及氧自由基的產生[17]。CRP是機體非特異性免疫的重要組成部分，可激活補體經典途徑，增強白細胞吞噬作用，調節淋巴細胞或單核-巨噬系統功能，促進巨噬細胞組織因子生成。IL-1β是前期炎癥免疫反應的重要誘導劑，能引起巨噬細胞的聚集與活化，激活的中性粒細胞向心肌組織內浸潤，進而通過過度炎癥反應引起心肌組織損傷[18]。本研究結果顯示，DHI可以顯著降低心梗模型大鼠血清中IL-1β、CRP和TNF-α的含量，減少炎癥細胞的浸潤和滲出，顯示出較好的抗炎作用。

心肌纖維化是心室重構的主要表現之一，不僅會引起心室壁僵硬、順應性降低、心臟收縮功能和同步性下降，致使心功能減退，嚴重者還會導致心源性猝死[19-20]。心梗后心室重構是指左心室形態和大小的改變，主要由3個因素參與：梗死區擴展、梗死愈合和室壁應力。心室重構的早期表現為梗死范圍的擴展，晚期表現則是非梗死區心肌的瘢痕修復致心室容量的增加和形態的改變[21]。上述這些改變，始于心肌缺血性壞死，是誘發心功能失調及心力衰竭的基礎，同時也是一種慢性漸進性過程，最終可引起嚴重的并發癥。本研究通過HE染色、MASSON染色，考察了DHI對心梗后心肌形態學的影響。結果表明，DHI可減輕心肌纖維化，減少心肌細胞壞死，降低心肌組織病變程度。

通常，類似研究都會選擇血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等腎素-血管緊張素-醛固酮系統抑制藥作為陽性對照藥。本研究之所以沒有設置該類藥物為陽性對照，是因為考慮到本研究的主要目的是考察DHI對心梗急性期損傷保護的作用機制。且該類藥物為口服制劑，相比于注射劑吸收慢，起效時間長，對于短期內缺血缺氧引起的心肌損傷的改善效果可能不明顯。另外，本研究僅根據臨床換算后設置了一個等效劑量組，未設置多個劑量組進行量效分析，后續研究有待進一步完善。

綜上所述，DHI可通過改善心梗模型大鼠心功能和心臟形態結構，減輕心肌損傷，抑制炎癥反應及心肌纖維化等途徑發揮其對心梗的保護作用。

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（收稿日期：2018-06-07 修回日期：2018-07-23）

（編輯：林 靜）