胰高血糖素樣肽1受體在大鼠慢性炎性痛發生機制中的作用

王健 牛云圃 崔佳 王磊 樊婷婷 張維

中圖分類號 R441.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2617-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.06

摘 要 目的：研究胰高血糖素樣肽1受體（GLP-1R）在大鼠慢性炎性痛發生機制中的作用。方法：取大鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水1組和完全弗氏佐劑（CFA）1組，另取大鼠隨機分為生理鹽水2組、CFA2組和（GLP-1R激動藥）GLP-1組（5 ?g/kg），采用左后足趾側注射CFA復制大鼠慢性炎性痛模型，后3組大鼠建模后第7天腹腔注射相應藥物，連續給藥1周。采用Hargreaves熱痛儀測定前3組大鼠建模前1 d（-1 d）、建模當天（0 d）和建模后1、3、7、14 d的舔足潛伏期，后3組大鼠建模后8、10、12、14 d的舔足潛伏期，每個時間點6只大鼠。建模后第7天，采用免疫熒光組織化學染色觀察模型組大鼠GLP-1R分子的分布情況。采用Western blot法檢測前3組大鼠建模后1、3、7、14 d背根神經節（DRG）中GLP-1R蛋白的表達水平，后3組大鼠建模后14 d DRG中GLP-1R、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）及IL-1β蛋白的表達水平，每個時間點3只大鼠。結果：與正常對照組和生理鹽水1組比較，CFA1組大鼠建模后1、3、7、14 d的舔足潛伏期明顯縮短（P<0.01），DRG中GLP-1R蛋白表達水平明顯降低（P<0.01），-1、0 d的舔足潛伏期差異無統計學意義（P>0.05）。GLP-1R分子與NeuN雙重標記明顯，且與降鈣素基因相關肽（CGRP）陽性神經元雙重標記明顯，與植物凝集素B4 （IB4）陽性神經元未見明顯雙重標記。與生理鹽水2組比較，CFA2組大鼠建模后8、10、12、14 d的舔足潛伏期明顯縮短（P<0.01），建模后14 d DRG中GLP-1R蛋白表達水平明顯降低（P<0.01），TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。與CFA2組比較，GLP-1組大鼠建模后8、10、12、14 d的舔足潛伏期明顯延長（P<0.05或P<0.01），建模后14 d DRG中GLP-1R蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）。結論：GLP-1R分子主要表達于DRG中的CGRP陽性神經元，其表達水平隨慢性疼痛的發生與發展而逐漸降低，且升高GLP-1R表達能夠有效緩解慢性炎性痛，其可能與降低DRG中炎癥因子的表達有關。

關鍵詞 胰高血糖素樣肽1受體；完全弗式佐劑；慢性炎性痛；炎癥因子；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the role of glucagon-like peptide 1 receptor （GLP-1R） on chronic inflammatory pain mechanism in rats. METHODS： The rats were randomly divided into normal control group， normal saline group 1 and complete Freunds adjuvant （CFA） group 1. Other rats were randomly divided into normal saline group 2， CFA 2 group and （GLP-1R agonist） GLP-1 group （5 ?g/kg）. Chronic inflammatory pain model was induced by left hind toe side injection of CFA. The latter 3 groups were given relevant medicine intraperitoneally on the 7th day after modeling， for consecutive a week. The licking incubation of the former 3 groups were determined by Hargreaves thermal pain instrument 1 d before modeling （-1 d）， on modeling day （0 d）， 1， 3， 7， 14 d after modeling； the licking incubation of the latter 3 groups were determined 8， 10， 12， 14 d after modeling； those of each 6 rats were determined at each time point. 7 d after modeling， distribution of receptor GLP-1R molecule in model group was observed by immunofluorescence double labeling. Western blot method was used to detect the expression of GLP-1R protein in dorsal root ganglia （DRG） of rats in former 3 groups 1， 3， 7 and 14 d after modeling. The expression of GLP-1R， TNF-α， IL-6 and IL-1β protein in DRG of rats were also determined in latter 3 groups 14 d after modeling； those of each 3 rats were determined at each time point. RESULTS： Compared with normal control group and normal saline group 1， licking incubation of CFA group 1 was shortened significantly 1， 3， 7， 14 d after modeling （P<0.01）， and the protein expression of GLP-1R in DRG was decreased significantly （P<0.01）； there was no statistical significance in licking incubation -1 and 0 d （P>0.05）. GLP-1R molecules were double labeled with NeuN and calcitonin gene-related peptide （CGRP）-positive neurons no significant double marker was found between GLP-1R molecules and phytohemagglutinin B4 positive neurons. Compared with normal saline group 2， licking incubation of CFA group 2 was shortened significantly 8， 10， 12， 14 d after modeling （P<0.01）； the protein expression of GLP-1R in RG was decreased significantly 14 d after modeling （P<0.01）； the protein expression of TNF-α， IL-6 and IL-1β were increased significantly （P<0.01）. Compared with CFA group 2， licking incubation of GLP-1 group was prolonged significantly 8， 10， 12， 14 d after modeling （P<0.05 or P<0.01）； the protein expression of GLP-1R in DRG was increased significantly 14 d after modeling （P<0.01）， and the protein expression of TNF-α， IL-6 and IL-1β were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： GLP-1R molecule is mainly expressed in CGRP-positive neurons of DRG. The expression level of GLP-1 receptor gradually decreases with the occurrence and development of chronic pain. The increase of GLP-1R expression can effectively relieve chronic inflammatory pain， which is related with reducing reduce the expression of inflammatory factors in DRG.

KEYWORDS Glucagon-like peptide 1 receptor； Complete Freunds adjuvant； Chronic inflammatory pain； Inflammatory factor； Rat

疼痛（Pain）是許多疾病的并發癥之一，尤其慢性痛的發生是當前困擾人類健康的頑疾，如組織損傷、神經長期壓迫、慢性感染等導致的神經病理性痛和慢性炎性痛[1-2]。然而目前在臨床上對疼痛的治療缺乏有效的手段[3-4]，嚴重影響了患者的生活質量和精神狀況，既影響疾病預后，又加重患者思想負擔，因此對慢性痛發生的機制研究迫在眉睫。既往研究表明，當慢性痛發生時，背根神經節（Dorsal root ganglion，DRG）內的衛星細胞會釋放大量的促炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）以及能夠增強脊髓背角神經元興奮性的神經生長因子（Nerve growth factor，NGF）、一氧化氮（NO）等，進而促進疼痛的發生和慢性化[5-8]。

胰高血糖素樣肽1受體（Glucagon-like peptide 1 receptor，GLP-1R）是一種G蛋白偶聯受體，通過Ca2+和蛋白激酶A信號通路傳遞信息，并且在神經系統中廣泛分布。新近研究表明，在脊髓背角，GLP-1R主要表達于小膠質細胞上，并且給予GLP-1R激動藥如GLP-1能夠有效緩解神經病理性痛、炎性痛和癌痛[9]。亦有研究報道，鞘內給予GLP-1R激動藥WB4-24能夠促進β-內啡肽的釋放，激活內源性鎮痛系統從而發揮鎮痛作用[10]。

DRG作為外界信息向中樞傳遞的樞紐，在慢性痛的發生與發展過程中扮演著重要的角色。DRG主要由神經元胞體組成，外面包繞衛星細胞。DRG中的神經元包括肽能神經元和非肽能神經元兩類。在炎癥、外周神經損傷等病理條件下，DRG（受損的或未受損的）內組胺受體、P2X家族受體等及通道的表達會發生相應變化。在炎性痛狀態下[11-12]，DRG鈉離子通道（如NaV1.3、NaV1.7～NaV1.9）以及瞬時感受器電位通道（TRP通道，如TRPV1、TRPA1等）均會出現顯著的表達上調，給予這些通道相應的抑制劑或阻滯藥均能夠顯著降低炎癥誘導的疼痛行為學改變。已有研究證實，在基因敲除小鼠實驗中，這些通道對于生理疼痛以及炎癥疼痛的傳遞都發揮著極為關鍵的作用[12]。新近研究表明[13]，DRG中衛星細胞分泌的基質細胞衍生因子1（SDF-1）與降鈣素基因相關肽（CGRP）能與神經元上的趨化因子受體CXCR4結合，參與疼痛的演變。這些結果表明，DRG離子通道/受體對炎性痛有著重要的作用，但對于廣泛分布于DRG中的GLP-1R的研究尚無文獻報道，因此本文將研究GLP-1R在慢性炎性痛發生機制中的作用，以期為鎮痛藥的開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Hargreaves熱痛儀（美國Stoeling公司）；Leica CM1950冷凍切片機（德國Leica公司）；3K30低溫離心機（美國Sigma公司）；BX-60共聚焦激光顯微鏡（日本Olympus株式會社）。

1.2 試劑

完全弗氏佐劑（CFA）、GLP-1（粉末狀晶體，批號：G8048，純度：99.5%）、4′ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和小鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）免疫球蛋白G（IgG）均購自美國Sigma公司；小鼠抗神經元核抗原（NeuN） IgG和兔抗GLP-1R IgG均購自英國Abcam公司；山羊抗CGRP IgG和Alexa488結合的驢抗小鼠 IgG均購自美國Invitrogen公司；Alexa594結合的驢抗兔IgG（美國Jackson Immuno Research公司）；兔抗白細胞介素6（IL-6）IgG、羊抗IL-1β IgG和小鼠抗TNF-α IgG抗體均購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的驢抗小鼠、兔、羊IgG均購自北京中杉金橋生物技建模有限公司；10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（美國Bio- Rad公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）。

1.3 動物

SD大鼠，♂，體質量為220～250 g，是由第四軍醫大學動物實驗中心提供的二級清潔動物，實驗動物生產許可證號：SCXK（軍） 2012-0007。所有大鼠均在22～25 ℃的恒定溫度下飼養，每天保證12 h的光照，可自由攝取水和食物。所有的實驗均在第四軍醫大學倫理委員會批準下進行。

2 方法

2.1 分組與建模

2.1.1 GLP-1R與慢性炎性痛的相關性實驗 取大鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水1組和CFA1組。正常對照組大鼠不作任何處理；CFA1組大鼠在乙醚麻醉狀態下于左后足趾側注射CFA 50 μL建立慢性炎性痛模型；生理鹽水1組大鼠同法注射等量生理鹽水。

2.1.2 機制研究實驗 另取大鼠隨機分為生理鹽水2組、CFA2組和GLP-1組。前2組大鼠分別在乙醚麻醉狀態下于左后足趾側注射生理鹽水或CFA 50 μL。GLP-1組大鼠在CFA2組基礎上，建模后第7天腹腔注射GLP-1，給藥量為每天5 ?g/kg（前期研究確定的劑量），每天同一時刻給藥，生理鹽水2組和CFA2組同時腹腔注射同等劑量的生理鹽水，均連續給藥1周。

2.2 熱痛行為學測試

采用行為學測試方法，測試前將Hargreaves熱痛儀基礎溫度調至37 ℃。于建模前1 d（-1 d）、建模當天（0 d）和建模后1、3、7、14 d，分別取正常對照組、生理鹽水1組和CFA1組大鼠各6只，放入罩有玻璃罩的有機材料檢測板上，待大鼠適應30 min后，將熱光源對準大鼠左側足底并開始計時，若大鼠出現縮足、舔足或撤足行為則被視為痛感陽性，否則視為痛感陰性。記錄大鼠的舔足潛伏期，舔足潛伏期的誤差值控制在0.1 s范圍內，并且舔足時間不能超過30 s，以免損傷大鼠后足。同法記錄生理鹽水2組、CFA2組和GLP-1組大鼠建模后8、10、12、14 d的舔足潛伏期。

2.3 免疫熒光組織化學染色觀察GLP-1R分布

建模后第7天，取CFA1組大鼠4只，腹腔注射水合氯醛（280 mg/kg）麻醉，用200 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）經主動脈沖洗血液至肝臟變白，之后灌注含4%多聚甲醛和50%飽和苦味酸的磷酸緩沖液（PB）。灌注完畢后立即取出大鼠腰椎L5 DRG，置于上述相同固定液中常溫搖床后固定1 h，之后移至含30%蔗糖的PB溶液中4 ℃脫水24 h直至組織塊沉底，再經恒冷箱切片機橫切背根節，片厚15 μm，切片在PBS中漂洗3次（每次10 min）后，分別用一抗[（兔抗GLP-1R IgG、小鼠抗NeuN IgG），（兔抗GLP-1R IgG、山羊抗CGRP IgG），兔抗GLP-1R IgG，稀釋比例均為1 ∶ 200]于4 ℃孵育切片36 h；隨后PBS沖洗3次（每次10 min），滴加對應二抗[（Alexa 594結合的驢抗兔 IgG、Alexa 488結合的驢抗小鼠 IgG、DAPI）、Alexa 594結合的驢抗兔 IgG、Alexa 488結合的驢抗羊 IgG、DAPI）、（Alexa 594結合的驢抗兔 IgG、IB4、DAPI），稀釋比例均為1 ∶ 500]，室溫下孵育4 h；PBS沖洗3次（每次10 min）后，在暗光下裱片，待自然風干后使用熒光封片液封片，激光共聚焦顯微鏡拍照，所有的切片都在相同染色和拍照條件（紅光波長：559 nm，綠光波長：488 nm，藍光波長：405 nm）下進行。

2.4 Western blot法檢測GLP-1R、IL-6、IL-1β和TNF- α蛋白表達

建模后第7天，腹腔注射水合氯醛 （280 mg/kg） 麻醉大鼠，用200 mL 4 ℃預冷的0.01 mol/L的PBS經左心室灌注，沖血完畢后，將大鼠于冰塊上快速取出腰椎L5 DRG，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中，超聲勻漿機將組織超聲（1.5 Hz，間隔30 s）勻漿裂解，將勻漿裂解液移入1.5 mL離心管，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，用BCA法進行蛋白濃度測定，確定含10 μg蛋白的上樣量。蛋白樣品采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，加入預染標準物marker，根據預染marker的位置確定所需蛋白GLP-1R及β-actin 的位置，將膠上蛋白電轉到PVDF膜上進行免疫雜交反應（PVDF膜預先在甲醇中浸泡1 min）。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，然后加入相應抗體[兔抗GLP-1R IgG（稀釋比例為1 ∶ 200）、兔抗IL-6 IgG（稀釋比例為1 ∶ 500）、小鼠抗IL-1β IgG（稀釋比例為1 ∶ 500）、小鼠抗TNF-α IgG（稀釋比例為1 ∶ 500）、小鼠抗β-actin IgG（稀釋比例為1 ∶ 500）]，4 ℃孵育過夜后使用TBST緩沖液洗膜3次（每次10 min），分別加入HRP標記的驢抗兔、小鼠IgG（稀釋比例為1 ∶ 1 000）室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次（每次10 min）后，使用化學發光液激發熒光并在Bio-Rad成像系統中進行熒光條帶的掃描，分析光密度（OD）值，以目標蛋白與β-actin的OD值之比計算各組大鼠目標蛋白的相對表達量。

2.5 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，以x±s表示。采用單因素方差分析比較各組大鼠熱痛行為學數據及蛋白定量數據的差異，邦弗朗尼（Bonferroni）事后檢定/檢驗法檢驗組間差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠建模后足底的熱痛行為學變化

與正常對照組和生理鹽水1組比較，CFA1組大鼠建模后1、3、7、14 d的舔足潛伏期明顯縮短（P<0.01），而-1、0 d的舔足潛伏期差異無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠不同時間點的舔足潛伏期見表1。

3.2 GLP-1R的分布

免疫熒光雙標結果顯示，GLP-1R與NeuN雙重標記明顯（見圖1A），GLP-1R與CGRP神經元雙重標記明顯（見圖1B），而GLP-1R在IB4陽性神經元中未見明顯雙重標記（見圖1C）。GLP-1R與DRG神經元免疫熒光雙重標記染色圖見圖1。

3.3 大鼠建模后DRG上GLP-1R蛋白表達水平

與正常對照組和生理鹽水1組比較，CFA1組大鼠建模后1、3、7、14 d的DRG上GLP-1R蛋白表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。各組大鼠DRG上GLP-1R蛋白表達的電泳圖見圖2，相對表達量檢測結果見表2。

3.4 GLP-1干預后大鼠痛感行為學變化

與生理鹽水2組比較，CFA2組大鼠建模后8、10、12、14 d的舔足潛伏期明顯縮短（P<0.01）。與CFA2組比較，GLP-1組大鼠建模后8、10、12、14 d的舔足潛伏期明顯延長（P<0.05或P<0.01）。GLP-1干預后各組大鼠不同時間點的舔足潛伏期見表3。

3.5 GLP-1干預后大鼠DRG上GLP-1R、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達水平

與生理鹽水2組比較，CFA2組大鼠建模后7 d DRG上GLP-1R蛋白表達水平明顯降低，IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達水平明顯提高（P<0.01）。與CFA2組比較，GLP-1組大鼠建模后7 d DRG上GLP-1R蛋白表達水平明顯提高，IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）。GLP-1干預后各組大鼠DRG上GLP-1R、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達的電泳圖見圖3，相對表達量的檢測結果見表4。

4 討論

本實驗通過足底注射CFA構建慢性炎性痛模型，由結果可觀察到CFA可以明顯誘導大鼠建模側后足熱痛敏；之后通過免疫熒光組織化學染色觀察到在DRG中GLP-1R分子與NeuN存在大量共存，并且在DRG神經元中，GLP-1R分子主要表達于CGRP陽性神經元。Western blot結果顯示，CFA可以明顯誘導DRG中GLP-1R分子的低表達，給予GLP-1可以觀察到DRG中GLP-1R分子的表達水平明顯增加，并且TNF-α、IL-6及IL-1β表達水平明顯降低。以上結果提示，GLP-1R分子在慢性炎性痛的發生與發展過程中扮演者重要的角色，因此，激活GLP-1R分子有望成為疼痛治療的新靶點，為鎮痛新藥的研制提供了參考。

既往研究顯示，當外周組織受到損傷或者炎癥反應的持續刺激時，損傷區域會釋放大量的炎癥因子，如組胺、促炎癥細胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）以及趨化因子（CXCL家族）等，這些炎癥因子會進一步引起DRG中神經膠質細胞的活化，激活的神經膠質細胞會不斷向相鄰的神經元釋放炎癥因子，促進DRG中神經元所處的微環境炎癥化，改變神經元的感受性，促進疼痛的發生[14-16]。本研究中，模型大鼠DRG中TNF-α、IL-6及IL- 1β水平明顯降低，提示GLP-1R分子可能介導DRG中炎癥反應，加劇了慢性痛信號的傳遞，但具體的機制還需進一步探究。

亦有研究表明，GLP-1R是一種內源性鎮痛受體，其在脊髓主要表達于小膠質細胞和神經元上[9]。當GLP-1與GLP-1R結合時，相當于內源性鎮痛系統被激活，達到鎮痛的目的。新近研究證實，鞘內給予GLP-1R的激動藥WB4-24可以有效緩解大鼠慢性痛行為，其作用的機制可能與β-內啡肽的釋放有關[10]。在本研究中，GLP-1R主要表達于DRG上的CGRP陽性神經元上，而CGRP陽性神經元作為DRG中的肽能小神經元，參與疼痛的發生與發展，由此可見，GLP-1R分子的下調可能與DRG中肽能神經元的功能改變密切相關。進一步研究發現，給予GLP-1可以觀察到DRG中GLP-1R的表達水平明顯增加，再結合促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β表達水平的明顯降低，提示上調GLP-1R的表達對逆轉DRG中肽能小神經元的功能變化具有十分重要的意義。

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（收稿日期：2018-03-08 修回日期：2018-08-03）

（編輯：鄒麗娟）