鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的藥動學研究

羅玲艷 張平 張賀 聶延君 羅永煌 羅雷

中圖分類號 R917；R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2467-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.05

摘 要 目的：建立測定Beagle犬血漿中鹽酸卡替洛爾質量濃度的方法，并對鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的藥動學行為進行研究。方法：采用乙腈沉淀法預處理血漿樣品。采用高效液相色譜法（HPLC）測定血藥濃度，色譜柱為VP-ODS C18，流動相為乙腈-0.067%磷酸氫二鈉溶液（13 ∶ 87，V/V），檢測波長為251 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。取健康Beagle犬6只，采用雙制劑雙周期自身交叉給藥方式，分別給予自制鹽酸卡替洛爾口腔崩解片（受試制劑）和進口鹽酸卡替洛爾片（參比制劑），劑量均為15 mg/只；于相應時間點取靜脈血，測定血漿中鹽酸卡替洛爾的血藥濃度。采用DAS 2.0軟件分別計算兩種制劑的藥動學參數，并計算受試制劑的相對生物利用度（F）；采用SPSS 20.0軟件比較兩種制劑的藥動學參數差異。結果：鹽酸卡替洛爾血藥濃度在9.77～1 250 ng/mL（r=0.999 7）范圍內線性關系良好，定量限和檢測限分別為3.6、1.2 ng/mL；提取回收率大于80%；精密度、穩定性試驗RSD均小于12%，準確度相對誤差均值在-8%～-2%以內。鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的主要藥動學參數cmax為（327.82±17.27）ng/mL，tmax為（0.54±0.10）h，AUC0-24 h為（1 136.09±172.69）ng·h/mL，AUC0-∞為（1 243.52±190.08）ng·h/mL；與參比制劑比較，F0-24 h為93.03%，F0-∞為95.45%。兩種制劑的lncmax和tmax差異均有統計學意義（P<0.05），lnAUC0-24 h差異無統計學意義（P>0.05）。結論：建立的HPLC法簡單、快速、準確，精密度和靈敏度較高，可用于鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的藥動學研究；與進口普通片比較，鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的吸收速度更快，而吸收程度無顯著性差異。

關鍵詞 鹽酸卡替洛爾；口腔崩解片；高效液相色譜法；Beagle犬；藥動學；生物利用度

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the determination of carteolol hydrochloride concentration in plasma of Beagle dogs， and to study pharmacokinetics of Carteolol hydrochloride orally disintegrating tablets in Beagle dogs. METHODS： The plasma samples were pre-treated by acetonitrile precipitation. HPLC method was adopted. The determination was performed on VP-ODS C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.067% disodium hydrogen phosphate solution （13 ∶ 87，V/V） at flow rate of 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 251 nm； the column temperature was 30 ℃； the sample size was 20 μL. Six healthy Beagle dogs were selected and given self-prepared Carteolol hydrochloride orally disintegrating tablets （test preparation） or imported Carteolol hydrochloride tablets （reference preparation）， 15 mg/dog by the way of double-preparation double-cycle crossover administration. Venous blood samples were collected at corresponding time points， and plasma concentration of carteolol hydrochloride was determined. The pharmacokinetic parameters of two preparations were calculated by using DAS 2.0 software， and relative bioavailability （F） of test preparation was calculated. The pharmacokinetic parameters of two preparations were compared by SPSS 20.0 software. RESULTS： The linear range of carteolol hydrochloride concentration in plasma was 9.77-1 250 ng/mL （r=0.999 7）. The limits of quantitation and detection were 3.6 and 1.2 ng/mL， respectively. The extraction recovery rates were higher than 80%； RSDs of precision and stability tests were all lower than 12%； average RE of accuracy were within -8% to -2%. The main pharmacokinetic parameters of Carteolol hydrochloride orally disintegrating tablets in Beagle dogs were as follows as cmax of （327.82±17.27） ng/mL， tmax of （0.54±0.10） h， AUC0-24 h of （1 136.09±172.69） ng·h/mL， AUC0-∞ of （1 243.52±190.08） ng·h/mL； compared with reference preparation， F0-24 h was 93.03%， F0-∞ was 95.45%. There was statistical significance in lncmax and tmax （P<0.05）， but no statistical significance in lnAUC0-24 h （P>0.05） between 2 kinds of preparations. CONCLUSIONS： The established HPLC method is simple， rapid， accurate， precise and sensitive， and can be used for pharmacokinetic study of Carteolol hydrochloride orally disintegrating tablets in Beagle dogs. Compared with imported tablet， absorption rate of Carteolol hydrochloride orally disintegrating tablets in Beagle dogs is faster， without significant difference in absorption degree.

KEYWORDS Carteolol hydrochloride； Orally disintegrating tablets； HPLC； Beagle dogs； Pharmacokinetics； Bioavailability

鹽酸卡替洛爾（Carteolol hydrochloride）是一種具有內在擬交感活性的非選擇性β受體阻滯藥，對β1、β2受體均有阻滯作用[1-2]，在臨床上主要用于心絞痛、心律不齊、高血壓、青光眼、法洛四聯癥、心血管神經癥等的治療[3-4]。迄今為止，鹽酸卡替洛爾是國外唯一一個上市用于治療心血管神經癥的β受體阻滯藥[5]，目前已有滴眼劑、片劑和緩釋膠囊等劑型上市。而《中國藥典》雖然從2000年版就已開始收載鹽酸卡替洛爾，但到2015年版為止僅收載有其滴眼液用于治療青光眼[6]，劑型和適應證均較單一。目前，該藥的口腔崩解片劑型研究在國內外鮮有報道，僅見本課題組進行的鹽酸卡替洛爾口腔崩解片的臨床前研究報道（部分技術內容已獲國家發明專利授權，專利號：CN101690720A）。該劑型在口腔內不需水或只需少量水即可快速崩解，具有吸收快、起效快、服用方便、首關效應小、對胃腸道刺激小等優點，特別適合老人、兒童及有吞咽困難或取水不便的患者[7-8]。本課題組以日本上市的鹽酸卡替洛爾普通片劑為參比制劑，對自制的鹽酸卡替洛爾口腔崩解片[9]在Beagle犬體內的藥動學行為進行研究，旨在為該制劑的后續研發和使用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀，包含SPD- M20A檢測器、LC-20AD泵等（日本島津公司）；TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TD3型低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；WH-1型微型低速渦旋混合器（上海滬西分析儀器有限公司）；KL512型氮吹儀（北京康林科技有限責任公司）；一次性負壓采血管（山東奧賽特醫療器械有限公司，規格：5 mL）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸卡替洛爾對照品（重慶北碚現代藥物研究所，批號：080801，純度：99.86%）；鹽酸卡替洛爾口腔崩解片（受試制劑，西南大學藥學院實驗室自制，批號：111109，規格：5 mg）；鹽酸卡替洛爾片（參比制劑，日本大冢制藥株式會社，批號：872123，規格：5 mg）；十二水磷酸氫二鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；乙腈（色譜純，天津四友精細化學品有限公司）；水為超純水。

1.3 動物

健康Beagle犬6只，雌雄各半，約9月齡，體質量8～10 kg，購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，動物生產許可證號：SCXK（渝）2007-0006。實驗前適應性飼養1周，未給予任何藥物。

2 方法

2.1 血藥濃度測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），預柱（20 mm×3.9 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.067%磷酸氫二鈉溶液（13 ∶ 87，V/V）；檢測波長：251 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸卡替洛爾對照品15 mg，置于100 mL量瓶中，用流動相溶解、定容，制成對照品貯備液，于4 ℃保存、備用。使用前取該貯備液適量，用流動相稀釋制成不同質量濃度的對照品溶液。

2.1.3 血漿樣品預處理 取血漿樣品400 μL，加入乙腈600 μL，渦旋混勻后，以10 000 r/min離心5 min，取上清液轉移至干凈尖嘴離心管中，40 ℃條件下氮氣吹干；殘渣加入流動相200 μL溶解，渦旋混勻，以10 000 r/min離心5 min，取上清液進樣測定。

2.1.4 專屬性試驗 取Beagle犬空白血漿、對照品血漿樣品（血藥濃度為156.3 ng/mL）、動物實驗血漿樣品（受試制劑給藥4 h時取樣）各適量，分別按“2.1.3”項下方法預處理，采用“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果表明，鹽酸卡替洛爾與各內源性物質均可實現良好分離。

2.1.5 線性關系、定量限和檢測限考察 取空白血漿樣品400 μL，分別加入“2.1.2”項下相應質量濃度的對照品溶液20 μL，渦旋混勻，制得質量濃度分別為9.77、19.53、39.06、78.13、156.3、312.5、625、1 250 ng/mL的系列對照品的血漿樣品，按“2.1.3”項下方法預處理，采用“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以鹽酸卡替洛爾血藥濃度（x，ng/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y=52 614x+585.09（r=0.999 7）。結果表明，鹽酸卡替洛爾血藥濃度在9.77～1 250 ng/mL范圍內線性關系良好；按照信噪比10 ∶ 1和3 ∶ 1計算，定量限和檢測限分別為3.6、1.2 ng/mL。

2.1.6 提取回收率試驗 按“2.1.5”項下方法制備鹽酸卡替洛爾低、中、高質量濃度（19.53、156.3、1 250 ng/mL）的血漿樣品，按“2.1.3”項下方法預處理，采用“2.1.1”項下色譜條件進樣測得峰面積（A1）；另取空白血漿樣品，同法預處理至“……氮氣吹干”，在殘渣中直接加入相應質量濃度的鹽酸卡替洛爾對照品溶液混勻，進樣測得峰面積（A2）。按公式（A1/A2×100%）計算提取回收率，每個質量濃度平行測定6次。結果，低、中、高質量濃度血漿樣品的平均提取回收率分別為82.95%、82.78%、80.50%，RSD分別為4.46%、4.40%、2.64%（n=6）。

2.1.7 精密度和準確度試驗 按“2.1.5”項下方法制備鹽酸卡替洛爾低、中、高質量濃度（19.53、156.3、1 250 ng/mL）的血漿樣品，同日內在6個不同時間點和連續3 d依法預處理并測定，每個質量濃度平行測定6次，考察方法精密度RSD和準確度相對誤差（RE）均值，結果見表1。

2.1.8 穩定性試驗 按“2.1.5”項下方法制備含鹽酸卡替洛爾低、高質量濃度（19.53、1 250 ng/mL）的血漿樣品，分別于室溫放置4 h、-20 ℃反復凍融3次、-20 ℃放置20 d以及按“2.1.3”項下方法預處理后室溫放置24 h，依法測定，每個質量濃度平行測定3次，考察上述條件下血漿樣品的穩定性，結果見表2。

2.2 動物實驗

2.2.1 分組與給藥 采用雙制劑雙周期自身交叉給藥方式。通過計算器生成的隨機數字將Beagle犬分為試驗組和對照組，每組3只。禁食不禁水12 h后，試驗組犬給予自制鹽酸卡替洛爾口腔崩解片，對照組犬給予進口鹽酸卡替洛爾片，劑量均為15 mg/只[10]。自制口腔崩解片給藥：先用水濕潤犬口腔，再將片劑放置于犬舌頭前部，閉合犬口腔大約3 min至片劑完全崩解后，給予5 mL水清洗口腔并使其咽下[11-12]；進口普通片給藥：將片劑置于犬咽喉部，閉合犬口腔待其自然咽下后，給予5 mL水再次使其咽下。給藥2 h后恢復正常飲水，4 h后恢復正常飲食[13-14]。間隔1周清洗期后，試驗組與對照組犬交叉給藥。

2.2.2 血樣采集及測定 對口腔崩解片給藥犬，分別于給藥后0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h時抽取血樣2 mL；對進口普通片給藥犬，分別于給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、16、24 h時抽取血樣2 mL。采血部位為犬后肢外側皮下小隱靜脈或前肢內側皮下頭靜脈。將血樣置于經肝素鈉處理的一次性采血管中，以4 500 r/min離心15 min，取上層血漿于-20 ℃下保存待測。測定時取出血漿樣品于室溫融化后，按“2.1.3”項下方法預處理，采用“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，根據隨行標準曲線計算血漿樣品中鹽酸卡替洛爾的血藥濃度。

2.3 統計學方法

采用DAS 2.0軟件處理血藥濃度數據，分別計算鹽酸卡替洛爾兩種制劑在Beagle犬體內的藥動學參數。其中，達峰濃度（cmax）和達峰時間（tmax）采用實測法、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）采用梯形法計算[15]；以進口鹽酸卡替洛爾片作為參比制劑，計算受試制劑口腔崩解片的相對生物利用度（F）。采用SPSS 20.0軟件對受試制劑和參比制劑的藥動學參數進行自然對數轉換后再進行方差分析（AUC、cmax）或直接進行Wilcoxon非參數檢驗（tmax）[16]，評價兩種制劑藥動學行為的差異。

3 結果

3.1 鹽酸卡替洛爾兩種制劑的平均血藥濃度-時間曲線

以血藥濃度的平均值對時間作圖，得到Beagle犬給予鹽酸卡替洛爾兩種制劑后的平均血藥濃度-時間曲線，詳見圖2。

3.2 鹽酸卡替洛爾兩種制劑的藥動學參數

鹽酸卡替洛爾兩種制劑在Beagle犬體內的主要藥動學參數見表3。

3.3 鹽酸卡替洛爾口腔崩解片的相對生物利用度

取6只Beagle犬服用鹽酸卡替洛爾口腔崩解片（受試制劑）和普通片（參比制劑）后的AUC0-24 h和AUC0-∞的平均值，根據相對生物利用度公式（F=AUC受試/AUC參比×100%），求得Beagle犬口服鹽酸卡替洛爾口腔崩解片后的F0-24 h為93.03%，F0-∞為95.45%。

3.4 鹽酸卡替洛爾兩種制劑的藥動學參數比較

將鹽酸卡替洛爾受試制劑和參比制劑的AUC0-24 h轉換為自然對數后進行方差分析，結果顯示，差異無統計學意義（P>0.05）；受試制劑的lnAUC0-24 h的90%置信區間為80.5%～103.7%，落在等效范圍（80%～125%）之內。將兩種制劑的cmax轉換為自然對數后進行方差分析，結果顯示，受試制劑的lncmax顯著更高，與參比制劑比較差異有統計學意義（P<0.05）；受試制劑的lncmax的90%置信區間為63.9%～70.9%，不在等效范圍（70%～143%）之內[11，16]。對兩種制劑的tmax進行非參數Wilcoxon檢驗，結果顯示，受試制劑的tmax更短，與參比制劑比較差異有統計學意義（P<0.05）。以上結果表明，鹽酸卡替洛爾自制口腔崩解片和進口普通片的吸收速度具有顯著性差異，而吸收程度無顯著性差異。

4 討論

口腔崩解片是指不需用水或只需用少量水，無需咀嚼，將片劑置于舌面遇唾液迅速溶解或崩解后，借吞咽動力使藥物入胃并起效的片劑。這種劑型的藥物可通過口腔或食道內的黏膜吸收，因而對胃腸道刺激性比普通片劑小；其具有服用方便、起效快、首關效應小等特點，是當前新型固體速釋制劑研究的熱點之一[17]。

本實驗以進口鹽酸卡替洛爾片為參比制劑，以自制鹽酸卡替洛爾口腔崩解片為受試制劑，采用雙制劑雙周期自身交叉給藥的方法在Beagle犬體內進行藥動學研究。結果顯示，兩種制劑在Beagle犬體內的lnAUC0-24 h比較差異無統計學意義，受試制劑的lnAUC0-24 h的90%置信區間也在等效性規定范圍內；受試制劑的lncmax顯著更高，tmax顯著更短，與參比制劑比較差異均有統計學意義，受試制劑的lncmax的90%置信區間未落在等效性規定范圍內。由此表明，與進口普通片比較，鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內吸收速度更快。此外，實驗過程中未發現Beagle犬出現嚴重的不良反應，僅在給藥后0.5～4 h內發現犬皮膚有發紅現象，但在給藥4 h后已逐漸恢復正常，具體原因有待進一步研究。

本研究選擇簡單常用的蛋白沉淀法對血漿樣品進行預處理，并對常用的甲醇、乙腈、高氯酸和三氯乙酸等蛋白沉淀劑[18-19]進行篩選。考慮到血漿樣品中待測物濃度較低，因此要求加入沉淀劑后的上清液能夠被濃縮富集，以確保足夠的檢測量。高氯酸和三氯乙酸均為水溶液，其蛋白沉淀后的上清液無法用氮氣吹干，也無法濃集。而采用乙腈和甲醇能同時實現樣品蛋白的沉淀與待測物的濃集，但預實驗發現乙腈的蛋白沉淀效果更好，因此最終選擇乙腈作為血漿樣品的蛋白沉淀劑。

綜上所述，本實驗建立了測定Beagle犬血漿中鹽酸卡替洛爾血藥濃度的HPLC法，結果表明該方法簡單、快速、準確，精密度和靈敏度較高，可用于鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的藥動學研究；同時，以該方法對鹽酸卡替洛爾口腔崩解片在Beagle犬體內的藥動學行為進行研究并考察其以進口普通片為參比制劑的相對生物利用度，結果表明鹽酸卡替洛爾口腔崩解片較之進口普通片的吸收速度更快，而吸收程度無顯著性差異。本研究可為鹽酸卡替洛爾口腔崩解片進一步的人體藥動學研究等提供實驗依據。

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（收稿日期：2018-02-24 修回日期：2018-07-20）

（編輯：段思怡）