養(yǎng)肺控瘤方對(duì)Lewis晚期肺癌小鼠的抑瘤作用及對(duì)白介素—2和腫瘤壞死因子—α表達(dá)的影響

沈水杰 徐玲俊

摘要 目的：觀察養(yǎng)肺控瘤方對(duì)Lewis晚期肺癌小鼠模型的抑瘤作用及對(duì)血清白介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響。方法：選取30只C57BL/6雄性小鼠，采用胸腔注射Lewis肺癌細(xì)胞懸液制作Lewis晚期肺癌小鼠。造模后隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、順鉑組、等效劑量中藥組、高劑量中藥組、順鉑+等效劑量中藥組、順鉑+高劑量中藥組，每組5只。計(jì)算各組抑瘤率，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-2、TNF-α的表達(dá)。結(jié)果：順鉑組、等效劑量中藥組、高劑量中藥組、順鉑+等效劑量中藥組、順鉑+高劑量中藥組的抑瘤率分別為57.52%，30.88%，51.15%，67.73%，82.75%。與空白對(duì)照組比較，各觀察組血清IL-2、TNF-α水平均得到顯著下降（P<0.05），順鉑+高劑量中藥組與順鉑組比較，血清IL-2、TNF-α水平顯著下降（P<0.05）。結(jié)論：養(yǎng)肺控瘤方能抑制腫瘤生長(zhǎng)，并能與順鉑協(xié)同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 養(yǎng)肺控瘤方；Lewis晚期肺癌；小鼠；抑瘤作用；白介素-2；腫瘤壞死因子-α

Abstract Objective：To observe the tumor-inhibitory effect of Yangfei Kongliu Fang and its effect on the expression of serum IL-2 and TNF-α in mouse models with advanced Lewis lung carcinoma. Methods：By using Lewis lung carcinoma cell suspensions via intrapleural injection， 30 male C57BL/6 mice were prepared into mouse models with advanced Lewis lung carcinoma. After model establishment， the mice were randomly divided into 6 groups： normal saline group （group C/control group）， cisplatin group （DDP group）， group treated with an equivalent dose of Chinese medicinals （group L）， group treated with a high dose of Chinese medicinals （group H）， group treated with cisplatin+equivalent dose of Chinese medicinals （group L+DDP）， and group treated with cisplatin+high dose of Chinese medicinals （group H+DDP）. Each group contained 5 mice and underwent corresponding intervention. Then， the tumor inhibition rate in each group was calculated， and the ELISA method was used to measure the expression of serum IL-2 and TNF-α. Results：The tumor inhibition rates in the DDP group， group L， group H， group L+DDP and group H+DDP were 57.52%， 30.88%， 51.15%， 67.73% and 82.75%， respectively. Compared with the control group， each treatment group achieved significant decreases in the levels of serum IL-2 and TNF-α （P<0.05）； and in group H+DDP as compared with DDP group， there were significant decreases in the levels of serum IL-2 and TNF-α （P<0.01）. Conclusion：Yangfei Kongliu Fang can inhibit tumor growth and can cooperate with cisplatin to reduce the expression of serum IL-2 and TNF-α in mouse models with advanced Lewis lung carcinoma.

Key Words Yangfei Kongliu Fang， Mouse with advanced Lewis lung carcinoma， Tumor-inhibitory effect， IL-2， TNF-α

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.043

原發(fā)性支氣管癌起源于支氣管黏膜或腺體，簡(jiǎn)稱(chēng)肺癌，是臨床最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率、死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)[1]，肺癌在城市腫瘤死亡順序中已經(jīng)由原來(lái)的第4位上升至第1位。70%～80%肺癌患者初診即為晚期，喪失了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)[2]。目前臨床將肺癌概括為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類(lèi)[3]。晚期非小細(xì)胞肺癌目前治療多采取綜合性治療，其中涵蓋放療、化療、分子靶向治療、免疫治療、中醫(yī)中藥治療、最佳支持治療等[4]。近年來(lái)臨床醫(yī)生更多的開(kāi)始追求患者生命質(zhì)量而不僅僅是殺滅和縮小腫瘤[5]。在長(zhǎng)期的晚期非小細(xì)胞肺癌的中西醫(yī)結(jié)合臨床實(shí)踐中，我科制定了養(yǎng)肺控瘤協(xié)定方，臨床療效確切，本研究通過(guò)制作晚期Lewis肺癌小鼠模型，探討?zhàn)B肺控瘤方治療晚期非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量平均（20±3）g，購(gòu)自常州卡文斯生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于室溫25 ℃，SPF級(jí)環(huán)境。

1.1.2 藥物 本研究使用中藥來(lái)自南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院中藥房，購(gòu)自南通三越中藥飲片有限公司。養(yǎng)肺控瘤方組成如下：黃芪45 g、生曬參15 g、北沙參30 g、薏苡仁30 g、白花蛇舌草30 g、仙鶴草30 g。藥物煎煮成等效劑量（按人鼠體表面積換算為2.43 g/kg，含生藥121.5 mg/mL），高劑量組（人等效劑量10倍為24.3 g/kg，含生藥1 215 mg/mL），藥液放置于4 ℃保存?zhèn)溆谩ｍ樸K（20 g/瓶，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2WA2A1308054A，加0.9%生理鹽水溶解并稀釋至0.2 mg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 10%小牛血清、1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，24孔板（含Transwell小室），購(gòu)自美國(guó)Coming公司，相關(guān)ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。低溫冰箱（THERMO Heto ULtra Freeze，美國(guó)）；低速臺(tái)式離心機(jī)（TDL-50B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；D-37520高速冷凍離心機(jī)（Thermo，Germany）；LX-100手掌型離心機(jī)（LX100 Bio-rad USA）；RF5301PC熒光分光光度儀（Shimadzu，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將30只小鼠以隨機(jī)數(shù)字表的方法隨機(jī)分為以下6組：空白對(duì)照組；順鉑組；等效劑量中藥組；高劑量中藥組；順鉑+等效劑量中藥組；順鉑+高劑量中藥組。將制備的Lewis肺癌細(xì)胞株細(xì)胞懸液（1×107細(xì)胞/mL），在每只小鼠腋后線第6肋間胸腔接種0.1 mL。接種細(xì)胞10 d，微型超聲提示胸腔種植和胸腔轉(zhuǎn)移，晚期肺癌模型建立成功。

1.2.2 給藥方法

空白對(duì)照組給予生理鹽水灌胃；順鉑組給予順鉑腹腔注射，2 mg/kg，隔天給藥；等效劑量中藥組給予人等效劑量的養(yǎng)肺控瘤方灌胃（按人鼠體表面積換算為2.43 g/kg）；高等劑量中藥組給予人等效劑量10倍的養(yǎng)肺控瘤方灌胃（按人鼠體表面積換算為24.3 g/kg）；順鉑+等效劑量中藥組給予順鉑腹腔注射聯(lián)合人等效劑量的養(yǎng)肺控瘤方灌胃；順鉑+高等劑量中藥組給予順鉑腹腔注射聯(lián)合人等效劑量10倍的養(yǎng)肺控瘤方灌胃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

藥物干預(yù)15 d。接種lewis細(xì)胞后25 d，采用摘眼球法取血0.4 mL，離心分離出血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清的IL-2、TNF-α。IL-2、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣、加酶、終止和吸光度（A）計(jì)算參考文獻(xiàn)[6-7]。第25天脫頸處死各組小鼠，剝?nèi)∧[瘤稱(chēng)取質(zhì)量。抑瘤率=（1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均質(zhì)量/空白對(duì)照組腫瘤平均質(zhì)量）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，比較用χ檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組抑瘤率比較 與養(yǎng)肺控瘤方組和順鉑組均顯示了明顯的腫瘤抑制作用。空白對(duì)照組與順鉑組、等效劑量中藥組、高劑量中藥組、順鉑+等效劑量中藥組、順鉑+高劑量中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。順鉑+等效劑量中藥組、順鉑+高劑量中藥組與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中西聯(lián)合組在腫瘤抑制方面優(yōu)于順鉑組（P<0.05）。順鉑+高劑量中藥組與順鉑+等效劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥各劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。順鉑組的抑瘤作用明顯強(qiáng)于單純中藥組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 6組IL-2、TNF-α檢測(cè)結(jié)果比較 除空白對(duì)照組外，其余5組IL-2、TNF-α水平均明顯下降，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。養(yǎng)肺控瘤方與順鉑聯(lián)合觀察組中，血清IL-2、TNF-α水平與順鉑組比較，也明顯下降（P<0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境和肺癌周?chē)拈g葉組織中都發(fā)現(xiàn)了大量的細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞[8]，之后的研究也已證明細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性炎性反應(yīng)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要的因素[9]。活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤作用，是人體免疫調(diào)節(jié)功能的主要細(xì)胞因子之一[10]。腫瘤壞死因子（TNF）是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由活化的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α組成[11]。它具有殺滅腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)大作用，與其他生物因子具有重要的協(xié)同作用，是人體質(zhì)量要的免疫保護(hù)遞質(zhì)。在長(zhǎng)期的晚期非小細(xì)胞肺癌的中西醫(yī)結(jié)合臨床實(shí)踐中，晚晚期非小細(xì)胞肺癌的基本證型以肺氣虧虛及氣陰兩虛兩型為主，根據(jù)“養(yǎng)正積自除”的治療原則，我科制定了養(yǎng)肺控瘤協(xié)定方。治療當(dāng)根據(jù)“養(yǎng)正積自除”的治療原則[12]。養(yǎng)肺控瘤方，以生黃芪、生曬參補(bǔ)益肺脾、益氣固本，北沙參養(yǎng)陰潤(rùn)肺，薏苡仁、仙鶴草健脾補(bǔ)虛，白花蛇舌草清熱解毒散瘤。全方益氣養(yǎng)陰，消瘤散結(jié)[13]。

實(shí)驗(yàn)研究顯示，養(yǎng)肺控瘤方具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，其與順鉑聯(lián)合有協(xié)同增效抑瘤作用[14]。抑瘤率方面，各觀察組均顯示了一定的腫瘤抑制作用。養(yǎng)肺控瘤方與順鉑聯(lián)合在腫瘤抑制方面優(yōu)于單純順鉑組。各觀察組對(duì)Lewis晚期肺癌小鼠血清IL-2、TNF-α均有不同的降低作用，養(yǎng)肺控瘤與順鉑聯(lián)合顯示了顯著的降低炎性反應(yīng)因子水平的作用。

綜上所述，養(yǎng)肺控瘤方能抑制Lewis晚期肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)，并能與順鉑協(xié)同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表達(dá)水平，其抑制腫瘤作用機(jī)制可能與免疫因素相關(guān)。

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