基于“腎應冬”探討下丘腦—垂體—腎上腺軸褪黑素水平的四季變化

孟依臨 畢晉 蔡榕琪 劉淼 劉曉燕 郭霞珍

摘要 目的：通過觀察對比正常組與模型組（摘除松果體）金黃地鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamus-Pituitary-Adrenal Axis，HPA軸）中褪黑素（Melatonin，MT）含量的季節性變化，進一步探討“腎應冬，主封藏”的生物學機制，中醫腎藏象的本質內涵及松果體在季節變化過程中的作用。方法：分別于春分、夏至、秋分、冬至日取出正常組與模型組金黃地鼠下丘腦、垂體、腎上腺組織，用酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法檢測各組織中MT含量。結果：金黃地鼠正常組下丘腦與垂體組織中MT含量均有季節性變化；金黃地鼠正常組的腎上腺組織的MT水平存在著明顯的四季差異，而松果腺摘除時則導致腎上腺組織原有的MT季節節律消失。其中正常組下丘腦MT含量變化表達趨勢為冬>夏>秋>春，模型組下丘腦MT含量變化表達趨勢夏>秋>冬>春。正常組垂體中MT含量變化表現趨勢為夏>春>冬>秋，模型組垂體中MT含量變化表現為夏>秋>春>冬。正常組腎上腺中MT含量變化表現趨勢為冬>夏>秋>春，模型組腎上腺中MT含量變化表現為夏>春>秋>冬。結論：下丘腦-垂體-腎上腺軸各水平的褪黑素水平存在四季節律變化；松果體對于下丘腦-垂體-腎上腺軸中腎上腺水平的褪黑素季節變化規律有直接的影響；冬季腎上腺的褪黑素水平高于其他三季，表明冬季褪黑素對腎上腺的功能影響最強。

關鍵詞 四季；金黃地鼠；褪黑素；下丘腦-垂體-腎上腺軸

Abstract Objective：To further explore the biological mechanism of “kidney corresponding with winter and governing storage”，and the essential connotation of Kidney′s Viscera Picture in Traditional Chinese Medicine and the role of pineal gland in the process of seasonal variations by observing and comparing the seasonal variation of the contents of melatonin （MT） in the hypothalamus-pituitary-adrenal axis （HPA axis） of golden hamsters between the normal group and the model group （Pinealectomy） Methods：Hypothalamus，pituitary and adrenal tissue were drawn from golden hamsters on spring equinox，summer solstice，autumn equinox and winter solstice and the contents of melatonin were determined by Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.Results：There was seasonal variation of MT level in the hypothalamus and pituitary tissue of hamsters in normal group； there was significant seasonal variation in the MT level of adrenal tissue in the normal group，while the seasonal rhythmicity of MT level of adrenal disappeared after pineal gland extirpation.The change trend of MT content in hypothalamus of normal group was winter>summer>autumn>spring，and the trend of expression of MT in hypothalamus of model group was summer>autumn>winter>spring.The change trend of MT content in the normal group was summer>spring>winter>autumn，while the content of MT in the model group was>summer>autumn>spring>winter.The change trend of MT content in normal group was winter>summer>autumn>spring，while the content of MT in adrenal gland of model group was>summer>spring>autumn>winter.Conclusion：Melatonin level had a seasonal pattern in various tissues of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis； Pineal gland had a direct effect on the seasonal variation of melatonin in the hypothalamus-pituitary-adrenal axis； The level of melatonin in the adrenal gland in winter was higher than that in the other three seasons，indicating that melatonin had the strongest effect on adrenal gland′s function in winter.

Key Words Seasons； Golden hamsters； Melatonin； Hypothalamus-pituitary-adrenal axis

中圖分類號：R221；R226文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.047

“腎應冬，主封藏”來源于《黃帝內經》中的“五臟應時”理論，《素問·六節藏象論》指出：“心者，生之本……為陽中之太陽，通于夏氣……肺者，氣之本……為陽中之太陰，通于秋氣……腎者，主蟄，封藏之本，精之處也……為陰中之少陰，通于冬氣”。“腎應冬”為其中的重要組成部分。它明確指出中醫五臟中的腎與自然四季中的冬季息息相關，腎的活動功能受四時陰陽變化的影響，故中國傳統醫學對腎功能的認識不僅在于對建立在解剖學基礎上腎的生理功能，更是將腎生理機能，與自然節氣、時辰之間存在著相應的適應性的變化結合起來。《素問·六節藏象論》指出：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也…，…為陰中之太陰，通于冬氣”。除了與冬季相通應，中醫的腎還具有主封藏特性。因此“腎應冬，主封藏”的研究對于進一步探討腎藏象實質內涵有一定的意義。通過大量臨床觀察及實驗發現，中醫的腎涵蓋了下丘腦-垂體-腎上腺皮質的機能[1]。故本實驗通過進一步觀察下丘腦-垂體-腎上腺軸褪黑素含量的四時變化及松果體對其的影響，探討“腎應冬，主封藏”的本質內涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 實驗動物為SPF級雄性敘利亞金黃地鼠，重量（130±20）g，數量16只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001；飼料由北京維通利華實驗動物中心提供的普通鼠全價顆粒飼料。

1.1.2 試劑與儀器 酶標儀：Thermo Multiskan MK3（產地：芬蘭）；生化儀：Beckmancoulter Uni Cel Dx C 600 Synchron（產地：美國）；孵育箱：泰斯特101-1AB型電熱恒溫鼓風箱（產地：中國）；洗板機：SUNOSTIK SAR-520B（產地：中國）；離心機：Beckman低溫高速離心機（產地：美國）；試劑盒：MT酶聯免疫試劑盒（北京瑞格博科技發展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組 實驗動物分別于春分、夏至、秋分、冬至前5周購入，隨機分為對照組與模型組，每組8只。其中模型組進行松果體摘除手術。飼養條件：自然光照，濕度50%～70%，室溫春季（22±2）℃、夏季（25±2）℃、秋季（20±2）℃、冬季（18±2）℃。正常組與模型組在相同飼養條件下飼養至春分、夏至、秋分、冬至當日，于晚08：00移至暗室，晚09：00開始取材。

1.2.1.2 模型制備 模型組：由水合氯醛及生理鹽水按1∶10比例配成10%溶液，將模型組金黃地鼠稱重后按0.4 mL/100 g，腹腔注射法進行給藥。麻醉后固定，消毒，剪去顱頂部毛，范圍為兩耳連線至眼睛后緣；再次用酒精消毒后，剪開皮膚，刮凈顱骨表面骨膜，暴露顱矢狀縫、人字縫。以顱骨人字縫和矢狀竇中心為原點，用特制電鉆鉆一直徑約為0.6 cm的圓洞，暴露矢狀靜脈，橫向靜脈竇，竇匯。沿矢狀靜脈兩側縱向切開硬腦膜，在近竇匯端與遠竇匯端分別結扎矢狀靜脈，剪斷，用眼科鑷在斷端（近竇匯端）取出松果體，把剪斷的矢狀靜脈放回原位，縫合皮膚，消毒。

1.2.2 取材 2組均于二分二至當日晚9：00在暗室5周紅光下斷頭取下丘腦，垂體，腎上腺組織，均投入液氮中，實驗結束后放入-80 ℃冰箱中待檢。

1.2.3 檢測指標與方法 將2組取出的下丘腦、垂體、腎上腺，分別用ELISA法，依照試劑盒說明書，檢測褪黑素含量。

1.3 統計學方法 正常組，模型組組間比較采用t檢驗，同一組春分、夏至、秋分、冬至組比較采用方差分析。各組數據均用平均值±標準差（±s）表示，運用SPSS 20.0統計軟件分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四季正常組與模型組金黃地鼠下丘腦組織中MT季節性含量變化的比較 四季正常組與模型組金黃地鼠下丘腦組織中MT季節性含量變化的比較。如表1所示，正常組春冬兩季金黃地鼠下丘腦MT含量存在顯著差異，有統計學意義（P<0.05），表現為春低冬高，表達趨勢為冬>夏>秋>春；模型組春夏兩季金黃地鼠下丘腦MT含量存在顯著差異，有統計學意義（P<0.05），表現為春低夏高，表達趨勢夏>秋>冬>春；模型組與相應的正常組下丘腦MT含量比較，春季存在統計學意義，且有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 四季正常組與模型組金黃地鼠垂體組織中MT季節性含量變化的比較 四季正常組與模型組金黃地鼠垂體組織中MT季節性含量變化的比較。如表2所示，正常組春夏冬三季金黃地鼠垂體中MT含量比較，差異有統計學意義（P<0.01），表現趨勢為夏>春>冬>秋；模型組四季金黃地鼠垂體中MT含量差異有統計學意義（P<0.001），表現為夏>秋>春>冬；模型組與相應的正常組垂體MT含量差異無統計學意義。見表2。

2.3 四季正常組與模型組金黃地鼠腎上腺組織中MT季節性含量變化的比較 四季正常組與模型組金黃地鼠腎上腺組織中MT季節性含量變化的比較。如表3所示，正常組春冬兩季金黃地鼠腎上腺中MT含量比較，差異有統計學意義（P<0.05），表現趨勢為冬>夏>秋>春；模型組四季金黃地鼠腎上腺中MT含量差異無統計學意義，表現為夏>春>秋>冬；模型組與相應的正常組腎上腺中MT含量比較，冬季差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

許多研究已證明“以時測臟”[2]方法的可行性，即從時間變化的角度認識人體這個有機的自然整體的生命活動，用以闡釋機體內各種生理、病理的活動變化所形成規律的本質和內涵。有關下丘腦-垂體-腎上腺軸褪黑素含量變化的研究多是集中于人為光照的改變，或晝夜節律的變化或冬夏二季的比較，本實驗用“以時測臟”的方法通過完善對四季下丘腦-垂體-腎上腺軸褪黑素含量變化的檢測分析及觀察松果體對下丘腦-垂體-腎上腺軸褪黑素含量的四時變化的影響，進一步探討“腎應冬，主封藏”本質內涵，并希望能對臨床研究治療具有季節性發病特征的疾病提供一定的理論依據。

本實驗結果比較顯示，金黃地鼠正常組下丘腦與垂體組織中褪黑素含量均有季節性變化，且均有統計學差異，其中正常組下丘腦組織中春冬兩季褪黑素含量差異有統計學意義，正常組垂體組織中春夏冬三季褪黑素含量差異有統計學意義。而摘除松果體的模型組下丘腦與垂體組織中褪黑素含量依舊顯示出季節變化的趨勢，其中模型組下丘腦組織中春夏兩季褪黑素含量差異有統計學意義，尤其模型組垂體組織中四季褪黑素含量差異有統計學意義。這一研究結果與之前的研究結果，即下丘腦與垂體均可自行分泌部分褪黑素是相符合的[3-5]。

本實驗研究結果還顯示，金黃地鼠正常組的腎上腺組織的褪黑素水平存在著明顯的四季差異，而松果腺摘除則導致腎上腺組織原有的褪黑素含量季節節律消失。本研究表明，正常組春冬兩季褪黑素含量比較有統計學意義，且冬季褪黑素含量高于其他三季，而松果腺摘除模型組褪黑素含量則幾乎無季節性變化。這說明松果體對于腎上腺水平上的褪黑素含量變化是起到直接作用的。有研究[6]發現，在下丘腦和垂體組織中存在褪黑素受體1亞型，這就提示褪黑素可以參與下丘腦以及垂體組織中的活動，并為此提供了神經生物學層面上的依據，而在同一區域共同存在褪黑素受體1亞型和促腎上腺皮質激素釋放激素提示褪黑素可能在下丘腦水平層次上直接參與并調節下丘腦-垂體-腎上腺軸活性。而在體外研究[7]中也發現，在大鼠腎上腺球狀帶組織細胞中加入褪黑素可以降低了氫化可的松的水平，說明了褪黑素直接作用于腎上腺皮質。

研究表明[8-9]，褪黑素在人體中的清除特點為：0點至3點之間褪黑素含量達到峰值，檢測可達80～150 pg/mL，但白天則下降，檢測只有10～20 pg/mL，其中血清半衰期為30～50 min。褪黑素分泌高峰為夜間，后逐漸下降，至白天維持低水平，而下丘腦-垂體-腎上腺軸的激素水平則是白天高夜間低，呈相反趨勢，因此可以認為褪黑素對下丘腦-垂體-腎上腺軸是具有一定的抑制作用。本實驗正常組腎上腺組織中褪黑素含量在冬季遠高于春夏秋三季，說明在冬季褪黑素對下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能抑制作用是最強的。下丘腦-垂體-腎上腺軸是機體神經內分泌系統的重要組成部分之一，參與及調節許多機體活動，可以控制機體應激反應，如免疫反應以及能量的貯存和消耗等。其作用過程為：首先由來自更高一級的腦調節中樞的應激信號促進室旁核神經元釋放促腎上腺皮質激素釋放激素和血管加壓素進入下丘腦正中隆起下方的垂體門脈系統，在垂體前葉，促腎上腺皮質激素釋放激素和血管加壓素共同作用下刺激促皮質激素細胞釋放促腎上腺皮質激素。促腎上腺皮質激素經由血液到達腎上腺皮質區，促進腎上腺合成糖皮質激素（人類體內合成皮質醇，嚙齒動物體內則合成皮質酮），糖皮質激素再反饋作用于室旁核和腺垂體，形成反饋調節環路[10]。通過作用過程我們可以了解到下丘腦-垂體-腎上腺軸在腎上腺水平上分泌的主要是一類甾體激素-糖皮質激素，糖皮質激素對下丘腦及垂體前葉起著負反饋作用，可以抑制促腎上腺皮質激素釋放激素及促腎上腺皮質激素的分泌。臨床研究[11-12]發現2型糖尿病患者唾液中的下丘腦-垂體-腎上腺軸激素水平顯著升高，褪黑素水平明顯降低。Torres-Farfan等[13]能在卷尾猴的腎上腺皮質區域發現存在MT1膜受體，并且可以表達G蛋白偶聯。發現給予低濃度的褪黑素在腎上腺移植體或腎上腺散在細胞中，可以抑制雙丁酰環磷腺苷及促腎上腺皮質激素引起的皮質醇增多，并且這一過程可被MT1/MT2受體拮抗劑Luzindole進行逆轉，說明褪黑素可以抑制促腎上腺皮質激素誘導的皮質醇產生。Saito等[14]比較了Broilers小雞組（新生小雞）和Layers小雞組（對應激更易感的小雞）腦組織褪黑素濃度。發現在夜間，Broilers組腦組織中褪黑素的濃度遠高于Layers組。而腦室內注射褪黑素后可以降低Layers組由于應激反應而升高的血皮質酮濃度。結合本實驗正常組腎上腺組織中冬季褪黑素含量最多，推斷冬季褪黑素對于腎上腺皮質分泌的糖皮質激素的含量及對糖皮質激素在機體的功能活動的抑制作用遠遠強于其他三季，糖皮質激素具有調節糖、脂肪和蛋白質的生物合成和代謝的作用，如促進糖異生，對胰高血糖素、兒茶酚胺等的脂肪動員有允許作用，還對免疫應答有抑制作用和抗炎、抗休克等作用。也就是說在冬季褪黑素對于糖皮質激素調節機體的能量合成與代謝等活動均有一定的抑制作用，并且抑制作用強于春夏秋三季。有研究[15]表明，在給予糖尿病患者外源性褪黑素1個月后，較治療前患者的空腹血糖及糖化血紅蛋白水平有明顯的改善。相關研究[16-18]表明褪黑素可改善鏈脲佐菌素和四氧嘧啶誘導的2型糖尿病模型大鼠的攝食飲水量、血糖和三酰甘油水平，這種調節作用可能與其使下丘腦-垂體-腎上腺軸活性降低，皮質酮分泌減少有關。還有研究[19-22]結果顯示，大劑量給予褪黑素可以降低糖尿病大鼠得血脂、血糖和丙二醛水平，抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，且效果強于小劑量，對糖尿病的急性代謝紊亂具有一定的保護作用。刺激主要的抗氧化酶如超氧化物歧化酶含量、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性并減少促氧化物的表達，有效改善體內氧化還原反應，穩定線粒體膜功能，防止神經氧化損傷的發生。相關研究[23]顯示，褪黑激的體積小并且具有兩親性，因此可以進入許多細胞和亞細胞的間隙內，發現褪黑素可以進入線粒體內，參與線粒體的能量代謝并且可以降低線粒體的功能損傷。而這種在冬季褪黑素對于糖皮質激素調節機體的能量合成與代謝，降低氧化應激等活動的抑制作用的表現與中醫“腎應冬，主封藏”的本質內涵是相符的。

“腎主封藏”的根本含義是腎藏精。《素問·六節臟象論》中有：“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”。中醫的“精”指的是構成人體和維持人體生命活動的基本物質的泛稱，是各種生命活動代謝的物質能量基礎。腎藏精是指腎具有貯藏人體之精的功能。“腎應冬”是指腎在四時的冬季起主要調節及表達作用，中醫的腎不僅僅指的是一個臟腑，而是一整套的以腎為主的臟腑系統。腎與冬季封藏特點相通應，在冬季，腎的封藏功能增強，處于主導地位，發揮著對自身其他四臟主要的調控作用，而在其他季節則處于從屬地位，協助或抑制其他四臟幫助機體順應四時而變，維持機體活動的穩定性。本研究結果表明，松果體直接作用于腎上腺軸所分泌的褪黑素的表達，使其成為自然界季節變化和中醫的腎功能變化之間的橋梁，令腎的功能活動與自然冬季變化相通。

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