苦苣菜水提物對機體炎性反應相關通路的調節作用及其機制研究

王振苗 董麗榮 賈評 田慧

摘要 目的：分析苦苣菜水提物對機體炎性反應相關通路的調節作用，并進一步對作用機制進行研究。方法：雄性健康SD小鼠100只，隨機分成10組，每組10只，5組進行耳腫實驗，5組進行足腫實驗。耳腫實驗與足腫實驗中，分別設置模型組、地塞米松（2 mg/kg）陽性藥物組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.13 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.065 g/10 g劑量組。檢測不同組間血清及炎性組織液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α及IL-6水平。結果：不同劑量組間小鼠耳廓腫脹度存在差異，各組腫脹抑制率分別為73.12%、43.62%、28.83%、9.61%。與模型組比較，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠耳廓腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強。不同劑量組間小鼠足跖腫脹度存在差異；各組腫脹抑制率分別為54.80%、35.09%、29.73%、17.46%。與模型組比較，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠足跖腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強。苦苣菜水提物對小鼠炎性組織液中炎性反應相關因子的影響：陽性對照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）?？嘬牟怂嵛飳π∈笱逯醒仔苑磻嚓P因子的影響：陽性對照組、苦苣菜水提物中劑量的COX-2、p38 MAPK水平與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；陽性對照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：苦苣菜水提物的抗炎機制涉及到炎性反應發生過程中的多個環節和炎性反應因子，有望研發成為有效的抗炎新藥，為防治炎性反應性疾病提供新的藥用和食療資源。

關鍵詞 苦苣菜水提物；炎性反應；通路；調節；機制

Abstract Objective：To analyze water extract of Sonchus Oleraceus on the regulation of related pathways of body′s inflammatory， and further investigate the mechanism of it. Methods：A total of 100 healthy male SD mice were randomly divided into 10 groups （n=10）. Five groups of mice were treated with ear swelling experiment， and foot swelling experiment was used in mice of another five groups. In ear swelling test and foot swelling experiments， model group and dexamethasone group （2 mg/kg） positive drug group， water extract of Sonchus 0.26 g/10 g dose group， water extract of Sonchus 0.13 g/10 g dose group and water extract of Sonchus 0.065 g/10 g group. The levels of COX-2， p38 MAPK， TNF-α and IL-6 in different serum and inflammatory tissue fluid of different groups were detected. Results：There were significant differences of ear swelling degree in different dose groups. The inhibition mice were 73.12%， 43.62%， 28.83%， respectively. Compared with the model group， mice auricle swelling with water extract of Sonchus oleraceus of different dose was inhibited， and with the increase of the dose， inhibition effect was enhanced. There were significant differences in the swelling degree of paw in different dose groups， and the inhibition rates were 54.80%， 35.09%， 29.73% respectively in each group. Compared with the model group， mice paw swelling with Sonchus oleraceus water extract of different dosage were inhibited， and with the increase of the dose， inhibition effect was enhanced. Effects of water extracted of Sonchus oleraceus related factors on the inflammatory tissue of mice in the solution： positive control group， Sonchus oleraceus water extracted dose and high dose group with COX-2， p38 MAPK， TNF-α， IL-6 levels compared with the model group， and there was significant difference （P<0.05）. Effects of water extract of Sonchus oleraceus of inflammation related factors in sera of mice： positive control group， Sonchus oleraceus water extract in dose of COX-2 and p38 MAPK levels compared with the model group， and there was significant difference （P<0.05）； The positive control group， water extract of Sonchus oleraceus middle dose group and high dose group of TNF-α and IL-6 levels compared with the model group， there was significant difference （P<0.05）. Conclusion：Anti-inflammatory mechanism of water extract of Sonchus oleraceus involves many aspects and inflammatory factors in the process of inflammation， which is expected to be developed into new anti-inflammatory drugs effectively， providing new medicinal and therapeutic resources for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

Key Words Water extract of Sonchus oleraceus； Inflammation； Pathway； Regulation； Mechanism

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.048

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.），又名：苦菜、滇苦菜、苦荬菜等，屬菊科，苦苣菜屬?？嘬牟藢僦参锏闹饕钚猿煞质潜栋胼祁惡忘S酮類，此外，還有香豆素類、甘油酸酯苷類、木脂素類等。苦苣菜及提取物具有降血糖、降壓、降脂、利尿、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。近年來，動物實驗發現苦苣菜屬植物可明顯抑制動物耳腫、足腫，抑制毛細血管的通透性，從而發揮抗菌、抗炎作用[2]。在臨床常與其他中藥配伍用于治療胃腸炎、肺炎、咽喉炎等多種疾病?？寡讬C制涉及到抗氧化、抑制NO生成和細胞凋亡等多方面內容，機制復雜，因此目前尚缺乏系統的闡明[3]。本課題通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠誘導小鼠后足跖腫脹建立動物模型，以探討苦苣菜水提物的抗炎作用；通過檢測小鼠炎性組織液和血清中環氧化酶（Epoxidase-2，COX-2）、p38絲裂原活化蛋白酶（p38 Mitogen-activated Protein Kinases，p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎性反應相關因子的水平變化，進一步分析苦苣菜水提物通過炎性遞質對機體炎性反應相關通路的調節作用，為防治炎性反應性疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性健康SD小鼠100只，體質量20～22 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號：SCXK（京）2014-0013。飼養于室溫（23.0±2.0）℃、濕度40%動物室內，自由攝食，飲水，1周后用于實驗，至實驗時體質量為30～35 g。

1.1.2 藥物 苦苣菜水提物的制備：稱取苦苣菜全草原生藥130 g，水中浸泡30 min，按照1∶10比加水煎煮60 min，收集濾液A，濾渣再次按1∶10加水煎煮45 min，得濾液B，合并兩次所得濾液，濃縮得1.3 g/mL濃縮液，冷卻，4 ℃保存待用。

1.1.3 試劑與儀器 Sigma4-15高速冷凍離心機（德國Sigma公司），Tecan Safire2酶標儀（意大利Tecan公司），LE225D電子天平（德國Sartorius公司），RE-52AA旋轉蒸發儀及電熱恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）等。二甲苯分析純（天津市永大化學試劑有限公司，批號20110707），角叉菜膠（德國Sigma公司，批號127H1227），COX-2酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）試劑盒、p38 MAPK（ELISA）試劑盒、TNF-α（ELISA）試劑盒、IL-6（ELISA）試劑盒（均購自北京冬歌生物科技有限公司，批號201501）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠隨機分成10組，每組10只，其中耳腫實驗和足腫實驗各5組。二甲苯致耳腫脹模型：末次給藥30 min后，于小鼠右耳內外兩側各涂抹二甲苯0.02 mL，30 min后處死小鼠，剪下左右耳，使用打孔器在雙耳同一部位打下等大的圓形耳片，稱重左、右耳片，以重量之差作為腫脹度。角叉菜膠致足跖腫脹模型：末次給藥30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜膠30 μL，5 h后處死小鼠，于跟骨水平對稱剪下鼠足，稱重左、右足，以重量差作為鼠足腫脹度。腫脹抑制率（%）=（模型組-給藥組）/模型組×100。

1.2.2 給藥方法 參照“常用動物與人體表面積比值表”，確定本次實驗各組苦苣菜水提物給藥濃度分別為0.26 g/10 g、0.13 g/10 g、0.065 g/10 g。稀釋1.3 g/mL濃縮液得各組所用溶液。耳腫實驗中分為耳腫模型組、地塞米松（2 mg/kg）陽性對照組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g、0.13 g/10 g及0.065 g/10 g劑量組。足腫實驗中分為足腫模型組、地塞米松（2 mg/10 g）陽性對照組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g、0.13 g/10 g及0.065 g/10 g劑量組。各組均采用灌胃（ig）給藥，苦苣菜水提物各劑量組給藥劑量按體質量計算（0.2 mL/10 g），陽性對照組按2 mg/10 g給予地塞米松磷酸鈉溶液，模型組給予等量生理鹽水。連續給藥5 d。

1.2.3 檢測指標與方法 炎性反應相關細胞因子和炎性遞質的含量測定。血清：室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min（3 000 r/min）。收集上清，-20 ℃冰箱保存備用。保存過程中如出現沉淀，可再次離心。炎性組織液：整個致炎小鼠足爪稱重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理鹽水中，充分浸泡。離心20 min（3 000 r/min，-4 ℃），制得炎性組織液，-20 ℃冰箱保存備用。依據ELISA試劑盒說明，應用雙抗體夾心法，檢測血清及炎性組織液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α及IL-6水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準а=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苦苣菜水提物對二甲苯所致小鼠耳腫的影響不同劑量組間小鼠耳廓腫脹度存在差異；各組腫脹抑制率分別為73.12%、43.62%、28.83%、9.61%。相較于模型組，苦苣菜水提物各組小鼠的耳廓腫脹均受到程度不等的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強。見表1。

2.2 苦苣菜水提物對角叉菜膠所致小鼠足腫的影響 不同劑量組間小鼠足跖腫脹度存在差異；各組腫脹抑制率分別為54.80%、35.09%、29.73%、17.46%。與模型組比較，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠足跖腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強。見表2。

2.3 苦苣菜水提物對小鼠炎性組織液中炎性反應相關因子的影響 陽性對照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 苦苣菜水提物對小鼠血清中炎性反應相關因子的影響 陽性對照組、苦苣菜水提物中劑量的COX-2、p38 MAPK水平與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；陽性對照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

炎性反應是指機體在致炎因子作用下所發生的以防御反應為主的病理過程。既有紅、腫、熱、痛、功能障礙等局部反應，也有發熱、白細胞種類和數量的變化等全身反應[4]。炎性遞質是指在炎性反應過程中在細胞或體液中產生的生物活性物質，其通過各種途徑作用于血管，造成血管擴張、通透性增加，在炎性反應的發生發展過程中發揮著重要作用[5]。本研究通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導小鼠后足跖腫脹建立急性炎性反應模型，以研究苦苣菜水提物對炎性反應的拮抗作用。本研究結果顯示，苦苣菜水提物可明顯改善二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹與角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹，且在本實驗范圍內，抑制效果與所用劑量呈正相關。提示苦苣菜水提物具有明顯的抗炎作用，與之前文獻報道相一致[6]。

炎性反應的發生涉及到多方面的因素，炎性反應遞質的產生與作用過程亦非常之復雜[7]。單靶點抗炎藥物往往無法獲得滿意療效，因此多靶點藥物的研發成為抗炎領域的研究熱點[8]。在我國歷史上很早就有苦苣菜被當做藥物使用的記載，在藥學專著《神農本草經》和《本草綱目》中都詳細記載了苦苣菜的藥理作用，由于藥性偏寒，味道較苦，被認為具有清熱解毒、涼血止血等功效，在腸炎、痢疾、吐血等病癥的治療方面取得顯著效果[9]?？嘬牟撕卸喾N活性成分，除槲皮素、槲皮黃甙、吡喃葡萄糖甙等黃酮類成分外，還含有多種人體必需的微量元素，被認為是具有多靶點抗炎作用的傳統中藥[10]。

目前，文獻報道較多的炎性反應通路主要包括細胞因子及其受體、一氧化氮途徑、花生四烯酸代謝途徑、MAPK信號及NFJB信號途徑等[11]。本研究主要選取COX-2-MAPK通路志TNF-α-IL-6通路對苦苣菜水提物的抗炎作用進行深入探討。

COX-2又稱前列腺素過氧化物合成酶，是前列腺素（PG）合成過程中一個重要的限速酶，可以將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，從而在機體的生理和病理過程中發揮作用。研究發現，COX-2與哮喘、類風濕性關節炎、骨關節炎等多種炎性反應性疾病的發生發展密切相關[12]。在多種炎性反應性疾病的滲出液中均可檢測到COX-2mRNA和COX-2蛋白的高表達[13]。因此，近年來COX-2被作為新型非甾體抗炎藥的作用靶點，從天然藥物中篩選有效的COX-2抑制劑成為研發新型抗炎藥物的有效途徑。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs）在細胞內廣泛存在[14]。目前已發現存在多條并行的MAPKs信號通路，哺乳類細胞主要存在以下3條并行的MAPKs信號通路：ERK（Extracellular Signal-regulated Kinase）信號通路，JNK（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）/SAPK（Stress-activated Protein Kinase，SAPK）通路與p38 MAPK通路。其中p38 MAPK通路在轉錄和翻譯水平參與了炎性反應遞質的合成調控，被認為是抗炎藥物的重要靶點。TNF-α是一種由內毒素激活的淋巴細胞所分泌的具有多活性的細胞因子，具有雙重生物學作用，一方面是機體免疫防護的重要遞質，另一方面也可參與機體的免疫病理損傷。TNF-α是迄今為止發現的具有抗腫瘤和炎性反應作用最強的細胞因子，同時還能刺激其他細胞因子如IL-4和IL-6的釋放，擴大后者的生物效應，作為一種重要炎性反應遞質為人們所重視。IL-6被稱為細胞因子的核心成員，是機體復雜的細胞因子網絡中的重要成員。已證明在多種自身免疫及腫瘤性疾病中均有異常，并與這些疾病的病情嚴重程度相關。IL-6可誘導淋巴細胞的分化，刺激肝細胞合成急性期反應蛋白，后者可促進中性粒細胞的活化與聚集，催化和放大炎性反應，對組織細胞帶來損害，因此被當做反映機體炎性反應和組織損傷嚴重程度的重要指標。IL-6不能刺激相應細胞分泌其他細胞因子，其主要免疫學功能是加強其他細胞因子的效果。許多研究表明，IL-6是某些自身免疫性疾病中的關鍵炎性因子，疾病的發生與轉歸密切相關[15]。本研究結果顯示，苦苣菜水提物可不同程度抑制COX-2、p38 MAPK的生成，對炎性反應遞質的合成起到有效的調控作用，進而緩解炎性反應的發生發展。

綜上所述，苦苣菜水提物的抗炎機制涉及到炎性反應發生過程中的多個環節和炎性反應因子，具有多靶點作用抗炎藥物的特點，符合目前抗炎有效藥物的研究方向，有望研發成為有效的抗炎新藥，為防治炎性反應性疾病提供新的藥用和食療資源。

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