大黃素和黃芩苷聯(lián)用對(duì)急性胰腺炎模型大鼠Akt/Nrf2通路的影響研究

李慧艷 張超 張松 徐灝 劉潔 李菲 楊琦

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）13-1754-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.07

摘 要 目的：研究大黃素和黃芩苷聯(lián)用對(duì)急性胰腺炎（AP）模型大鼠的改善作用和機(jī)制。方法：將70只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃素組（250 mg/kg）、黃芩苷組（250 mg/kg）、奧曲肽組（陽(yáng)性對(duì)照，10 μg/kg）、N-乙酰半胱氨酸組（陽(yáng)性對(duì)照，180 mg/kg）和大黃素+黃芩苷組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷），每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均復(fù)制AP模型，造模成功后靜脈注射給予相應(yīng)藥物。在給藥后3、6、12、24 h，測(cè)定各組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶水平；在給藥24 h后，檢測(cè)大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）和胰腺組織中半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase-3）水平，并采用Western blot法檢測(cè)各組大鼠胰腺組織中蛋白激酶B（Akt）磷酸化和核因子E2相關(guān)因子2 （Nrf2）蛋白表達(dá)水平。另取40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃素+黃芩苷組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷）和大黃素+黃芩苷+LY294002（Akt特異性抑制劑）組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷+100 mg/kg LY294002），每組10只，進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。同法造模、給藥，24 h后檢測(cè)大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，從給藥后3 h開(kāi)始，模型組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶水平即顯著升高（P<0.01）；給藥后24 h，大鼠血清中MDA、MPO和胰腺組織中Caspase-3水平均顯著升高（P<0.01），血清中SOD、GSH和胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，從給藥后6 h開(kāi)始，各給藥組大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平均顯著降低（P<0.01）；給藥24 h后，各組大鼠血清中MDA、MPO和胰腺組織中Caspase-3水平均顯著降低（P<0.01），血清中SOD、GSH和胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，與大黃素+黃芩苷組比較，大黃素+黃芩苷+LY294002組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：大黃素和黃芩苷聯(lián)用對(duì)AP模型大鼠具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Akt磷酸化以上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，并促進(jìn)其下游抗氧化酶的表達(dá)，從而降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 大黃素；黃芩苷；急性胰腺炎；氧化應(yīng)激；蛋白激酶B；核因子E2相關(guān)因子2；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of emodin combined with baicalin on acute pancreatitis （AP） model rats and its possible mechanism. METHODS： A total of 70 rats were randomly divided into sham operation group， model group， emodin group （250 mg/kg）， baicalin group （250 mg/kg）， octreotide group （positive control， 10 μg/kg）， N-acetyl cysteine group （positive control， 180 mg/kg）， emodin+baicalin group （125 mg/kg emodin+125 mg/kg baicalin）， with 10 rats in each group. Except for sham operation group， AP model was induced in each group. After modeling， relevant medicines were given intravenously. After 3， 6， 12， 24 h of medication， the serum levels of amylase and lipase were determined. After 24 h medication， serum levels of SOD， MDA， GSH， MPO and level of Caspase-3 in pancreatic tissue were determined. The levels of Akt phosphorylation and expression of Nrf2 protein in pancreatic tissue of rats were determined by Western blot assay. Another 40 ratss were randomly divided into sham operatsion group， model group， emodin+baicalin group （125 mg/kg emodin+125 mg/kg baicalin） and emodin+baicalin+LY294002 （Akt specific inhibitor） group （125 mg/kg emedin+125 mg/kg baicalin+100 mg/kg LY294002）， with 10 ratss in each group. Mechanism verification test was performed. The modeling and medication method of those groups were same to above groups， 24 h later. The level of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein were determined in pancreatic tissue of rats. RESULTS： Compared with sham operation group， the serum levels of amylase， lipase of rats were significuntly increased in model group after 3 h of medication （P<0.01）； levels of MDA， MPO in serum and Caspase-3 in pancreatic tissue were significantly increased in model group （P<0.01）， while the levels of SOD， GSH in serum and the levels of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein were decreased significantly in pancreatic tissue of rats（P<0.01）. Compared with model group， the serum levels of amylase and lipase were decreased significantly in administration groups after 6 h of medication （P<0.01）. After 24 h medication， the levels of MDA， MPO in serum and Caspase-3 in pancreatic tissue were decreased significantly （P<0.01）， while the levels of SOD， GSH in serum and the levels of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein were increased significantly in pancreatic tissue of rats （P<0.01）. In mechanism verification test， compared with emodin+baicalin group， the levels of Akt phosphorylation and the expression of Nrf2 protein in pancreatic tissue were decreased significantly in emodin+baicalin+LY294002 group （P<0.01）. CONCLUSIONS： Emodin combined with baicalin shows certain improvement effect on AP rats， the mechanism is that the level of Akt phosphorylation is promoted so as to up-regulate the expression of Nrf2 protein， and the expression of antioxidant enzyme is promoted so as to reduce the level of oxidative stress in AP model rats.

KEYWORDS Emodin； Baicalin； Acute pancretitis； Oxidative stress； Akt； Nrf2； Rats

急性胰腺炎（Acute pancretitis，AP）是指胰腺內(nèi)的胰酶被激活后，引發(fā)胰腺組織發(fā)生自身消化反應(yīng)，從而造成的胰腺損傷，特別是重癥急性胰腺炎（SAP），病情嚴(yán)重而且發(fā)展較快，還會(huì)伴發(fā)其他器官的損傷，死亡率高達(dá)20%～30%[1]。近年來(lái)的文獻(xiàn)研究表明，氧化應(yīng)激在AP的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著極其重要的角色，而且還與胰腺以外其他器官的損傷有著密切關(guān)系[2]。當(dāng)體內(nèi)氧化自由基水平增加，抗氧化酶活性降低時(shí)，會(huì)引起炎癥反應(yīng)和微循環(huán)障礙，從而引起細(xì)胞凋亡和組織損傷，最終導(dǎo)致胰腺和其他器官的損傷[3]。因此，抗氧化損傷對(duì)治療胰腺炎及其伴發(fā)的其他器官損傷具有積極作用。蛋白激酶B（Akt）/核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，可調(diào)節(jié)組織內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)而發(fā)揮抗氧化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控Akt/Nrf2通路，可發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，從而治療小鼠AP及其并發(fā)癥[4-5]?？梢?jiàn)，尋找可以激活A(yù)kt/Nrf2信號(hào)通路的藥物，將對(duì)治療AP有很大的幫助。

大黃和黃芩聯(lián)合應(yīng)用治療AP見(jiàn)于多個(gè)中藥組方，比如清胰湯、大承氣湯、大黃柴苓湯、胰炎靈顆粒等，應(yīng)用廣泛，療效確切[6]。其中大黃素是中藥大黃的主要成分之一，可以通過(guò)抑制胰酶生成、抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能等機(jī)制發(fā)揮治療AP作用[7]。黃芪中的黃芩苷對(duì)AP大鼠組織中炎癥因子具有很好的抑制作用[8]，還可通過(guò)增加腎組織中超氧化物歧化酶（SOD）和血紅素氧合酶1（HO-1）的蛋白含量改善AP大鼠伴發(fā)的腎損傷[9]?？梢?jiàn)，大黃素和黃芩苷對(duì)AP均有一定的改善作用，那么兩者合用是否有增效作用還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。由于常用于治療胰腺的中藥方劑清胰湯中大黃和黃芩的比例為 1 ∶ 1，且在預(yù)實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)以此比例配伍應(yīng)用效果較好，故本研究擬在AP大鼠模型基礎(chǔ)上，聯(lián)合給予大黃素和黃芩苷（1 ∶ 1），研究二者的增效作用及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Selectra-E全自動(dòng)生化分析儀（荷蘭威圖科學(xué)公司）；Infinite F50全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；蛋白凝膠電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：20151017，純度：>98%）、大黃素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：20151103，純度：>98%）均購(gòu)自西安賽德有機(jī)科技有限責(zé)任公司；牛磺膽酸鈉（批號(hào)：86349，純度：98%）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，批號(hào)：A750，純度：>99%）、Akt特異性抑制劑LY294002（批號(hào)：M2128，純度：98%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；醋酸奧曲肽注射液（瑞士諾華制藥有限公司，批號(hào)：H20150948，規(guī)格：0.1 mg/mL）；SOD（批號(hào)：20170105）、丙二醛（MDA，批號(hào)：20170213）、谷胱甘肽（GSH，批號(hào)：20170122）、髓過(guò)氧化物酶（MPO，批號(hào)：20170204）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3，批號(hào)：20170123）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司；血清淀粉酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20170315）、血清脂肪酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20170311）均購(gòu)自溫州東歐公司；兔抗大鼠Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、Nrf2和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

健康Wistar大鼠110只，清潔級(jí)，♂，6周齡，體質(zhì)量190～230 g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCKX（軍）2007-007]。大鼠購(gòu)入后采用滅菌標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，期間自由飲水，室溫控制在20～25 ℃，濕度控制在40%～70%。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃素組（250 mg/kg）、黃芩苷組（250 mg/kg）、大黃素+黃芩苷組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷）、NAC組（180 mg/kg）和奧曲肽組（10 μg/kg），每組10只，進(jìn)行藥效及機(jī)制考察實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證蛋白分子之間的作用，重新取40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃素+黃芩苷組（250 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷）和大黃素+黃芩苷+LY294002組（125 mg/kg大黃素+125 mg/kg黃芩苷+100 mg/kg LY294002），進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（檢測(cè)大鼠胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達(dá)水平）。NAC和奧曲肽給藥劑量根據(jù)臨床使用劑量折算而來(lái)，大黃素和黃芩苷根據(jù)臨床常用劑量設(shè)定，比例根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。模型組和給藥組大鼠均采用50 g/L的牛磺膽酸鈉經(jīng)十二指腸行膽胰管逆行進(jìn)行加壓注射，注射速度為0.1 mL/min，制備大鼠AP模型[9]；假手術(shù)組大鼠開(kāi)腹后僅翻動(dòng)胰腺，隨即關(guān)腹。給藥組大鼠造模后立即靜脈注射給予相應(yīng)劑量的藥物；假手術(shù)組和模型組大鼠給予相同體積的生理鹽水。

2.2 樣本采集與處理

分別在大鼠給藥后3、6、12、24 h抽取血液標(biāo)本，于EP管中靜置，然后以1 500×g低溫離心 10 min，吸取血清并分裝于凍存管中，放-80 ℃冰箱凍存，用于測(cè)定血清中淀粉酶、脂肪酶及其他生化指標(biāo)；末次取血后采用頸椎脫臼法處死大鼠，取胰腺組織測(cè)定其中蛋白表達(dá)情況。

2.3 血清中淀粉酶和脂肪酶水平的測(cè)定

按照測(cè)試盒方法進(jìn)行操作，檢測(cè)各組大鼠給藥后3、6、12、24 h血清中淀粉酶和脂肪酶水平，測(cè)定儀器為全自動(dòng)血生化分析儀。

2.4 血清中SOD、MDA、GSH和MPO水平的測(cè)定

給藥24 h后，各組大鼠血清中SOD水平采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，GSH水平采用分光光度法測(cè)定，MDA水平采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，MPO水平采用酶化學(xué)法測(cè)定，各指標(biāo)測(cè)定步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作完成。

2.5 胰腺組織中Caspase-3水平的測(cè)定

取50 mg胰腺組織，加入冰組織裂解液500 μL，組織研磨儀研磨5 min至無(wú)組織塊，冰浴10 min，然后以 10 000×g離心10 min，收集上清，置于-80 ℃冰箱中凍存。用檢測(cè)緩沖液按1 ∶ 10的比例稀釋?zhuān)捎帽壬y(cè)定各組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。

2.6 胰腺組織中 Akt磷酸化及Nrf2 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

采用Western blot法測(cè)定除奧曲肽和NAC組外其余各組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化及Nrf2蛋白表達(dá)水平。取胰腺組織，與組織蛋白提取液一起在組織勻漿機(jī)上勻漿，然后10 000×g離心10 min，收集組織上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）法對(duì)上清液中蛋白定量，然后將蛋白置于-70 ℃冰箱中保存，備用。蛋白在100 ℃條件下變性后，取等量蛋白（25 μg）上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉后，用相應(yīng)一抗 （1 ∶ 1 000）在4 ℃下孵育，振蕩過(guò)夜；TBST液漂洗3遍，羊抗兔二抗（1 ∶ 5 000）孵育1 h；TBST液漂洗3遍，采用化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒顯影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Quantity one軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白和內(nèi)參（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，以p-Akt/Akt比值表示Akt的磷酸化水平。將假手術(shù)組比值設(shè)置為1，以其他組與假手術(shù)組的比值計(jì)算其相對(duì)值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中淀粉酶和脂肪酶水平的測(cè)定結(jié)果

從給藥后3 h開(kāi)始，模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平均顯著高于假手術(shù)組（P<0.01），而且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)血清中淀粉酶和脂肪酶水平逐漸升高。大黃素和黃芩苷單獨(dú)給藥時(shí)，均可以降低模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平，但在給藥后3 h時(shí)與模型組比較差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從給藥后6 h開(kāi)始差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而大黃素和黃芩苷聯(lián)合給藥時(shí)，可顯著降低模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平，且從給藥后3 h開(kāi)始與模型組比較差異即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而且與相同時(shí)間點(diǎn)的單用大黃素和黃芩苷比較，聯(lián)用效果更好，且與奧曲肽和NAC效果相當(dāng)。給藥不同時(shí)間后各組大鼠血清中淀粉酶水平的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，脂肪酶水平的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 血清中MDA、MPO、SOD和GSH水平的測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MDA、MPO水平顯著增加（P<0.01），而SOD、GSH水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠血清中MDA、MPO水平均顯著降低（P<0.01），SOD和GSH水平均顯著升高（P<0.01），且大黃素+黃芩苷組大鼠血清中SOD和GSH水平顯著低于大黃素組和黃芩苷組（P<0.01）。各組大鼠血清中MDA、MPO、SOD、GSH水平的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 胰腺組織中Caspase-3水平的測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，大黃素+黃芩苷組、奧曲肽組和NAC組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平顯著降低（P<0.01），并且大黃素+黃芩苷組顯著低于大黃素組和黃芩苷組（P<0.01），與奧曲肽組和NAC組效果相當(dāng)（P>0.05）。各組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3.4 胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），且大黃素+黃芩苷組顯著低于大黃素組、黃芩苷組（P<0.01）。各組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

3.5 機(jī)制驗(yàn)證結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，大黃素+黃芩苷組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與大黃素+黃芩苷組比較，大黃素+黃芩苷+LY294002組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。各組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化和Nrf2蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖2，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

4 討論

奧曲肽是臨床常用的治療胰腺炎的藥物，具有較好的治療效果；NAC對(duì)大鼠胰腺炎具有很好的治療效果，而且其主要通過(guò)抗氧化發(fā)揮的作用，因此本研究選擇這兩個(gè)藥物為陽(yáng)性對(duì)照藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，血清淀粉酶和血清脂肪酶聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷AP患者具有重要意義[10-11]。在本研究中，模型組大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平均顯著升高，符合AP模型特征，提示造模成功。大黃素和黃芩苷單獨(dú)給藥后從6 h開(kāi)始，對(duì)模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平有一定的抑制作用；而二者聯(lián)用時(shí)，在3 h時(shí)即可顯著抑制模型大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶水平，表明兩者聯(lián)用效果優(yōu)于單用。

氧自由基生成過(guò)多和抗氧化酶系統(tǒng)的破壞被認(rèn)為是導(dǎo)致AP發(fā)生時(shí)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素，同時(shí)也是導(dǎo)致全身性氧化應(yīng)激的主要因素[12]。為了反映藥物對(duì)體內(nèi)氧化應(yīng)激的作用，本研究測(cè)定了血清中氧化指標(biāo)MDA、MPO、SOD和GSH的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中MDA和MPO水平較假手術(shù)組均顯著升高（P<0.01），表明造模后大鼠處于較高的氧化應(yīng)激水平。大黃素和黃芩苷單獨(dú)給藥后，血清中MPO和MDA水平有所降低，而二者聯(lián)用后大鼠血清中MPO和MDA水平進(jìn)一步降低，表明大黃素和黃芩苷聯(lián)用能夠有效促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)，且效果優(yōu)于單用。

體內(nèi)過(guò)量的氧自由基和炎癥因子會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡是一種機(jī)體自我保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制，但過(guò)量的凋亡會(huì)造成組織壞死，引起組織損傷[13]。Caspase家族在介導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡信號(hào)中具有重要作用，其中Caspase-3在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要角色[14]。在本研究結(jié)果中，模型組大鼠胰腺組織中Caspase-3水平顯著升高，表明凋亡被過(guò)度激活；大黃素和黃芩苷單獨(dú)給藥后大鼠胰腺組織中Caspase-3水平被不同程度地抑制，而二者聯(lián)用時(shí)則進(jìn)一步降低了Caspase-3水平，發(fā)揮出更好的抗凋亡作用。

Nrf2蛋白是各種細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要核轉(zhuǎn)錄蛋白，機(jī)體在受到刺激或者某些激活劑作用時(shí)，Nrf2被激活后轉(zhuǎn)移入核，通過(guò)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）調(diào)控一系列抗氧酶表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力[15]。當(dāng)Nrf2缺失或者激活有障礙時(shí)，細(xì)胞對(duì)刺激源的敏感性增加，會(huì)引起炎癥、凋亡或癌變等反應(yīng)[16]。在本研究中，模型組大鼠胰腺組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組，表明Nrf2的激活受阻。當(dāng)給予大黃素和黃芩苷后，大鼠胰腺組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高，而兩者聯(lián)用時(shí)Nrf2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，效果優(yōu)于單用。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其磷酸化后被激活，可以調(diào)控下游靶基因表達(dá)，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡都有著密切的聯(lián)系[16]。同時(shí)，Akt激活后可以促進(jìn)Nrf2蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)。在本研究中，模型組大鼠胰腺組織中Akt磷酸化水平降低，而給藥后Akt磷酸化水平顯著升高，表明大黃素和黃芩苷聯(lián)用可以激活A(yù)kt信號(hào)通路。LY294002是一種Akt的特異性抑制劑，與藥物同時(shí)給予大鼠后發(fā)現(xiàn)，其可阻斷Akt的激活，Nrf2蛋白表達(dá)量也顯著降低，表明大黃素和黃芩苷聯(lián)用通過(guò)Akt通路調(diào)節(jié)Nrf2蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮治療AP作用。

綜上所述，大黃素和黃芩苷聯(lián)用對(duì)AP的改善效果優(yōu)于大黃素和黃芩苷單用，大黃素和黃芩苷聯(lián)用可通過(guò)Akt通路調(diào)控Nrf2蛋白表達(dá)，促進(jìn)其下游抗氧化酶的表達(dá)，從而降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，最終發(fā)揮治療AP作用。本研究結(jié)果為臨床開(kāi)發(fā)相關(guān)制劑，證明大黃素和黃芩苷的聯(lián)用效果提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-11-09 修回日期：2018-03-01）

（編輯：林 靜）