苗藥黑骨藤多指標的含量測定及聚類分析

劉育辰 劉麗蘋 劉剛 金文淵 龍毅 黃明喆 楊欣

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1636-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.12

摘 要 目的：建立同時測定苗藥黑骨藤中綠原酸和杠柳毒苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Xtimate C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。采用SPSS 23.0統計軟件根據藥材樣品中綠原酸和杠柳毒苷的含量進行聚類分析。結果：綠原酸、杠柳毒苷檢測進樣量線性范圍分別為0.040 6～1.8 μg（r=0.999 4）、0.016 8～2.3 μg（r=0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于5.0%；定量限分別為0.918 0、0.084 3 μg/mL，檢測限分別為0.102 0、0.025 3 μg/mL；加樣回收率分別為102.66%～104.00%（RSD=0.53%，n=6）、96.44%～100.79%（RSD=1.73%，n=6）；耐用性試驗的RSD均小于3.0%。18份藥材樣品可聚為三大類，即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，S8為一類。結論：該方法可用于黑骨藤藥材的質量控制和品質評價；不同產地黑骨藤藥材中綠原酸和杠柳毒苷的含量有較大差異，各成分含量與產地有一定關聯。

關鍵詞 黑骨藤；綠原酸；杠柳毒苷；含量測定；聚類分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of chlorogenic acid and periplocin in Miao medicine Periploca forrestii. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Xtimate C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm， and column temperature was maintained at 25 ℃. The sample size was 10 μL. Cluster analysis was conducted according to the content of chlorogenic acid and periplocin in samples by SPSS 23.0 software. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid and periplocin were 0.040 6-1.8 μg（r=0.999 4） and 0.016 8-2.3 μg（r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 5.0%. The quantitation limits were 0.918 0， 0.084 3 μg/mL， and detection limits were 0.102 0， 0.025 3 μg/mL， respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The recoveries were 102.66%-104.00%（RSD=0.53%，n=6）， 96.44%-100.79%（RSD=1.73%，n=6），respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The result indicated that 18 batches of samples were divided into 3 categories by cluster analysis. S2， S4， S10， S12 and S14-S18 were divided into one category； S1， S3， S5-S7， S9， S11 and S13 were divided into another category； S8 was regarded as one category. CONCLUSIONS： The method can be applied for quality control and evaluation of P. forrestii. The contents of chlorogenic acid and periplocin in P. forrestii from different producing areas are different greatly. There is a certain correlation between the content of each component and the producing area.

KEYWORDS Periploca forrestii； Chtorogenic acid； Periplocin； Content determination； Cluster

黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，又名飛仙藤、黑骨頭、柳葉過山龍、滇杠柳等，苗語稱嘎八又賒、銳松怪、蛙蟒塞，其味苦，辛、溫，有小毒，具有祛風除濕、通經活絡之功效，多用于治療風濕關節痛、跌打損傷、乳腺炎、閉經等病癥。主要分布在貴州、云南、廣西、西藏等地，生長于2 500米以下山地疏林向陽處、陰濕雜木林下及灌木叢中[1-2]。

黑骨藤藥材通常為野生，無規范種植基地，藥材質量難以控制，目前仍執行的是2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[3]，此標準中只有來源、性狀、顯微鑒別和理化鑒別等傳統項目。研究發現，黑骨藤藥材含有黃酮類[4]、香豆素類[5]、強心苷類[6]、三萜類[6]、酚酸類[7]、C21甾類[4]、神經酰胺類[8]等多種成分，但目前其含量測定主要集中于總皂苷[9]、總黃酮[10]、黃酮苷[11]、強心苷[12]等單一指標。藥理實驗證明，黑骨藤藥材中咖啡酰基奎寧酸類成分和滇杠柳苷類成分分別具有抗類風濕性關節炎[13]和強心作用[14]。因此，本研究以上述兩類活性成分的代表綠原酸和杠柳毒苷作為質量控制指標，采用高效液相色譜法（HPLC）對貴州省不同產地的黑骨藤藥材中兩種成分的含量進行測定，并進行聚類分析，以便更全面地評價其質量。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate-3000 型HPLC儀，包括自動進樣系統、柱溫箱、二級管陣列檢測器和Chromeleon 色譜工作站[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；DRHH-2型數顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設備有限公司）；Q-2508型高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司）；JT1003型電子分析天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（批號：MUST-16031610，純度：>98%）、杠柳毒苷對照品（批號：MUST-16072202，純度：>98%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

18份藥材樣品采自貴州省不同產地（見表1），經貴陽中醫學院劉剛實驗師鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，9%→10% A；12～30 min，10%→21% A；30～50 min，21%→35% A；50～60 min，35%→70% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品5.08 mg，置于5 mL量瓶中，以流動相溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為1.016 mg/mL的綠原酸對照品溶液；精密稱取杠柳毒苷對照品8.40 mg，置于10 mL量瓶中，以流動相溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為0.840 mg/mL的杠柳毒苷對照品溶液。再精密量取上述綠原酸對照品溶液2 mL、杠柳毒苷對照品溶液1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成綠原酸、杠柳毒苷質量濃度分別為0.040 6、0.016 8 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末2.0 g，按料液比1 ∶ 25加入70%乙醇溶液50 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，于70 ℃水浴蒸干，加25 mL水使成混懸液，分別依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次，將3次正丁醇萃取液合并，濃縮至干，殘渣用適量甲醇溶解，轉移并定容至10 mL量瓶中，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果，理論板數按綠原酸、杠柳毒苷峰計應大于5 000；保留時間分別為17.2、46.0 min，表明基線分離良好。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、5、10、14、20、25 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸、杠柳毒苷回歸方程分別為y=36.258x-0.765 8（r=0.999 4）、y=19.240x-0.269 5（r=0.999 9）。結果表明，綠原酸、杠柳毒苷檢測進樣量線性范圍分別為0.040 6～1.8、0.016 8～2.3 μg。

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結果，綠原酸、杠柳毒苷定量限分別為0.918 0、0.084 3 μg/mL，檢測限分別為0.102 0、0.025 3 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸、杠柳毒苷峰面積的RSD分別為0.16%、1.64%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）8份，分別于室溫下放置1、3、5、9、12、15、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、杠柳毒苷峰面積的RSD分別為4.15%、1.34%（n=8），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取藥材樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.230 8、0.062 2 mg/g，RSD分別為 4.17%、2.41%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量藥材樣品（編號：S1）6份，每份1 g，分別加入綠原酸、杠柳毒苷對照品溶液各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 耐用性試驗

2.10.1 流速考察 精密稱取藥材樣品（編號：S2）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項下色譜條件（流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.232 4、0.062 1 mg/g，RSD分別為2.54%、1.70%，表明流速一定程度波動能滿足試驗要求，本方法耐用性良好。

2.10.2 柱溫考察 精密稱取藥材樣品（編號：S2）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項下色譜條件（柱溫分別為25、30、35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.231 5、0.061 0 mg/g，RSD分別為0.90%、2.70%，表明柱溫一定程度波動能滿足試驗要求，本方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

取18份藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

2.12 聚類分析

以各共有峰相對峰面積為變量，采用SPSS 23.0統計軟件對藥材樣品進行聚類分析，采用組間平均數聯結法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式，結果見圖2。由圖2可見，聚類譜系中，將18份藥材樣品聚為三大類：即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，S8為一類。

3 討論

由表3可知，藥材樣品中綠原酸含量為0.047 1～0.376 0 mg/g，貴陽市烏當區相思河產藥材樣品中綠原酸含量最低，安順市產藥材樣品中綠原酸含量最高；杠柳毒苷含量為0.016 1～0.485 2 mg/g，貴陽市烏當區相思河產藥材樣品中杠柳毒苷含量最低，安順市產藥材樣品中杠柳毒苷含量最高。從各地區藥材樣品2種成分含量上來看，綠原酸和杠柳毒苷含量似有所關聯，即貴陽市烏當區相思河產藥材樣品上述2種成分含量均最低，而安順市產藥材樣品上述2種成分含量均最高，綠原酸含量兩產地藥材樣品相差約8倍，杠柳毒苷含量兩產地藥材樣品相差約30倍。筆者采樣過程中發現，黑骨藤藥材生長對周圍生態環境的選擇性非常強，它喜歡生長在向陰、水分充足的密林中。而安順市藥材產地環境恰恰符合上述特點。

聚類分析結果表明，綠原酸和杠柳毒苷含量與黑骨藤藥材的產地具有一定的聯系。18份藥材樣品主要聚為三大類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，它們所處地理位置均在貴陽市以北區域；S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，它們所處地理位置基本在貴陽市以南區域；而自成一類的S8，其所處地理位置也在貴陽市以南區域。

綜上所述，本方法可用于黑骨藤藥材的質量控制和品質評價；不同產地黑骨藤藥材中綠原酸和杠柳毒苷的含量有較大差異，各成分含量與產地有一定關聯。本結論為該藥材最佳產地的確定奠定了一定基礎，有助于指導藥材種植及采收。

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（收稿日期：2017-11-29 修回日期：2018-01-03）

（編輯：張 靜）