MTHFR C677T基因多態性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關性研究

翁秋燕 查芹 牛艷芳

流行病學調查顯示，腦卒中已成為全球第二常見的死亡原因，我國的第一大死亡原因[1]。缺血性腦卒中約占腦卒中的80%[2]。2型糖尿病患者發生缺血性腦卒中的風險是非糖尿病患者的1.5～3倍[3]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種蛋氨酸代謝過程中產生的非蛋白氨基酸。高Hcy血癥被認為是發生缺血性腦卒中的獨立危險因素，約20%～50%的缺血性腦卒中患者存在不同程度的高Hcy血癥[4]。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶 （5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代謝過程中的關鍵酶之一。MTHFR C677T的位點錯義突變可引起亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低，導致血漿Hcy水平升高。本研究分析急性缺血性腦卒中合并2型糖尿病患者的MTHFR C677T基因分布特點及Hcy水平，探討兩者與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的關系，為進一步探索急性缺血性腦卒中合并2型糖尿病的發病機制提供依據，現將研究結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年6月至2017年5月寧波大學醫學院附屬醫院神經內科住院的急性缺血性腦卒中患者200例。其中合并2型糖尿病患者（AIS+DM組）100例，男 59 例，女 41 例，年齡 40～82（62.46±10.24）歲。原有2型糖尿病78例，新診斷22例。不合并2型糖尿病患者（AIS組）100例，其中男56例，女44例，年齡42～85（61.09±9.59）歲。納入標準：（1）年齡 40～85 歲；（2）腦梗死的診斷標準符合“中國急性缺血性腦卒中診治指南2010”[5]，并且經頭顱 MRI檢查證實；（3）2 型糖尿病均符合1999年WHO糖尿病的診斷標準。排除標準：（1）其他類型糖尿病；（2）心、肝、腎功能不全，嚴重感染，腫瘤，其他內分泌及自身免疫性疾病、腦血管畸形；（3）近期服用B族維生素、葉酸者；（4）原始資料不全，不配合相關檢查者。另選取同期寧波大學醫學院附屬醫院健康體檢者100例為對照組，其中男55例，女45例，年齡41～83（60.84±10.52）歲。本研究獲得寧波大學醫學院附屬醫院倫理委員會同意，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 血生化指標檢測 所有研究對象均空腹≥8h，于次日清晨空腹采肘靜脈血，采用美國BECKMAN全自動生化免疫流水線檢測 FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖化血紅蛋白（HbA1c）、Hcy、葉酸水平。根據3組對象的MTHFR C677T不同基因型，比較各基因型亞組的Hcy水平。

1.2.2 類肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗（the trial of ORG 10172 in acute stroke treatment，TOAST）病因分型[6]根據TOAST病因分型，將AIS+DM組和AIS組分為5個亞型：（1）大動脈粥樣硬化性卒中（large-artery atherosclerosis，LAA），（2）小動脈閉塞性卒中（small artery occlusion，SAO），（3）心源性腦栓塞（cardio embolism，CE），（4）其它確定原因引發的缺血性卒中（stroke of other demonstrated etiology，SOE），（5）原因不明性缺血性卒中（stroke of undemonstrated etiology，SUE）。根據兩組患者的TOAST病因分型，比較TOAST分型亞組的MTHFR C677T基因多態性。

1.2.3 MTHFR C677T基因多態性檢測 所有對象采集空腹外周靜脈血5ml，EDTA抗凝，-20℃冰箱保存，備用。采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶長度多態性方法（PCR-RFLP）作 MTHFR C677T 基因多態性檢測：（1）基因組DNA抽提（1～1.5h）：用酚-氯仿法常規抽提基因組DNA。（2）PCR擴增C677T所在位點的MTHFR基因（2h）：以抽提得到的基因組DNA為模版，對C677T所在位點的片段進行PCR擴增。設計上游引物序列為：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCG-3′；下游引物序列為：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。PCR反應試劑盒購自北京泰百克生物技術有限公司。配制20μlPCR反應體系：10μl上述 PCR 配方、1μl全血、1μl上游引物、1μl下游引物、加水補足20μl。PCR擴增條件：95℃變性1min 后開始循環，95℃變性反應 30s，58℃退火 30s，72℃延伸反應1min，進入25個循環，最后72℃反應5min，16℃保存。（3）對PCR產物進行酶切：反應結束后進行酶切，酶切體系包含有PCR產物，HifI酶，酶切緩沖液和水，37℃水浴鍋中酶切 1h。（4）電泳檢測（1～1.5h）：在2.5%的凝膠上進行電泳，加入原PCR產物和酶切后的溶液以及小分子量核酸 Marker，100v恒壓電泳40min。對結果使用凝膠成像儀進行拍照和記錄。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用LSD-t檢驗，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用logistic回歸分析計算OR值95%CI。用Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組對象臨床及實驗室指標的比較 見表1。

由表1可見，3組對象性別、年齡、TC、TG、HDL-C比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。AIS+DM組與AIS組患者的收縮壓、FPG、LDL-C水平均高于對照組（t=4.760、12.961、4.440，6.345、5.254、4.914，均P＜0.05）。AIS組及對照組的舒張壓、Hcy水平均低于AIS+DM組（t=1.815、6.875，3.437、8.835，均P＜0.05）。AIS組及對照組的葉酸水平均高于AIS+DM組（t=-9.635、-9.010，均P＜0.05）。

表1 3組研究對象臨床及實驗室指標的比較

2.2 AIS+DM組與AIS組的TOAST病因分型比較 兩組TOAST病因分型中，無一例為SOE，其它4型比較見表2。

表2 AIS+DM組與AIS組的TOAST病因分型比較[例（%）]

由表2可見，兩組患者的TOAST病因分型比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

此外，群體代表性檢驗結果發現，AIS+DM組、AIS組及對照組MTHFR C677T基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示樣本具有群體代表性。

2.3 MTHFR C677T基因多態性分析 見圖1。

由圖1可見，MTHFR基因C677T經過PCR擴增后可以得到198bp長的DNA片段。PCR產物經過限制性內切酶Hin f I作用后：如果為純合子突變（TT型），酶切后得到172bp片段；如果為野生型（CC型），酶切后僅有198bp片段；如果為雜合子突變（C/T型），酶切后會得到2個片段：包含198bp和172bp 2個片段。

2.4 3組對象MTHFR C677T基因多態性頻率的比較見表3。

表3 3組對象MTHFRC677T基因多態性頻率的比較[例（%）]

由表3可見，3組對象的MTHFR C677T基因型頻率、等位基因頻率的比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。AIS+DM組患者MTHFR C677T基因型頻率與對照組比較，差異有統計學意義（χ2=14.755，P＜0.05）。AIS+DM組患者T等位基因頻率高于AIS組，但差異無統計學意義（χ2=11.536，P ＞0.05）。AIS+DM 組、AIS組患者等位基因頻率與對照組比較，差異均有統計學意義（χ2=12.275、5.349，P＜0.05）。

2.5 AIS+DM組與AIS組患者TOAST病因分型亞組MTHFR C677T基因多態性比較 見表4。

由表4可見，AIS+DM組與AIS組患者不同TOAST病因分型亞組的MTHFR C677T基因型頻率、等位基因頻率分布中，在SAO亞組水平，AIS+DM組與AIS組MTHFR C677T基因型頻率比較，差異有統計學意義（χ2=6.673，P＜0.05）。在LAA亞組水平，AIS+DM組T等位基因頻率大于AIS組，差異有統計學意義（χ2=4.102，P＜0.05）。

2.6 3組MTHFR C677T不同基因型者Hcy水平的比較 見表5。

表4 AIS+DM組與AIS組患者TOAST病因分型亞組MTHFR C677T基因多態性比較[例（%）]

表5 3組MTHFR C677T不同基因型者Hcy水平的比較（μmol/L）

由表5可見，3組CT型、TT型對象的血漿Hcy水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。AIS+DM組CT型、TT型Hcy水平均大于AIS組及對照組，差異均有統計學意義（t=-11.448、-10.726，-15.387、-10.116，均P＜0.05）。

2.7 AIS+DM組患者多因素非條件logistic回歸分析結果 以AIS合并DM為因變量Y，分別對MTHFR C677T 基因型、高 Hcy、性別、TG、LDL-C、HDL-C 等進行多因素logistic回歸分析，見表6。

由表6可見，影響腦梗死合并2型糖尿病發生的獨立因素為LDL-C、葉酸、高Hcy、MTHFR攜帶T等位基因（MTFHRC CT/T7）、高血壓。從OR值來看，葉酸是保護性因素；LDL-C、高Hcy、MTHFR C677T攜帶T等位基因（MTFHRC CT/T7）、高血壓是危險因素。

表6 AIS+DM組患者多因素非條件logistic回歸分析結果

3 討論

缺血性腦卒中是由遺傳因素與環境因素共同作用的多因子疾病。傳統的高危因素包括高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙等。近年來，高Hcy血癥被視為急性缺血性腦卒中發生的獨立危險因素[7-8]，其在AIS的具體機制包括：（1）通過抑制一氧化氮合酶減少NO生成，對血管內皮產生毒性損傷血管內皮的舒張功能，從而影響腦梗死后新生血管及側支循環的形成；（2）促進多種炎癥介質及炎癥因子的合成，激活動脈壁的慢性炎癥反應，進一步導致動脈粥樣硬化；（3）引起血管內皮損傷，增加泡沫細胞生成，促進動脈粥樣硬化的發生、發展。

本研究顯示，AIS+DM組患者的血漿Hcy水平明顯高于AIS組及對照組，差異有統計學意義。多因素logistic回歸分析，提示高Hcy是影響腦梗死合并2型糖尿病發生的危險因素。Zhu等[9]對165例2型糖尿病患者進行MTHFR C677T基因多態性檢測，其中伴有缺血性卒中患者23例，結果顯示CT型、TT型的腦卒中發生率分別為18%、21%，明顯高于CC型6%，差異有統計學意義。TT型的血漿Hcy水平高于CT型及CC型。但該研究病例選擇不是隨機的，存在一定的局限性。趙小頔等學者[10]研究2型糖尿病合并腦梗死組的血清Hcy水平高于單純2型糖尿病組。

高Hcy血癥影響腦梗死合并2型糖尿病發生的機制尚未明確，可能包括：胰島素通過影響Hcy代謝中的某些酶如胱硫醚B合成酶的活性增高血漿Hcy水平，從而刺激血管平滑肌細胞向血管內膜移動及增殖，加重血管內膜增生，誘發動脈粥樣硬化及胰島素抵抗[11]。Hcy與糖基化終末產物相互作用后使血栓調節蛋白分泌增加，其與糖基化終末產物在血管內皮損傷過程中相互協同[12]。

MTHFR C677T基因多態性的分布因不同地域、不同人種存在差異。本研究中T等位基因頻率在AIS+DM組、AIS組及對照組分別為56.5%、50.5%、39.0%。與學者趙小頔等[10]AIS+DM組T等位基因頻率64.81%研究結果相近。目前國內外關于MTHFR C677T基因多態性與腦梗死合并2型糖尿病相關性的研究尚少，結果存在爭議。Zhu等[9]研究認為純合子及雜合子中的T等位基因攜帶均增加2型糖尿病發生腦梗死的風險，其中T等位基因為危險因素，C等位基因可能是保護性因素。另有研究發現，MTHFR C677T TT型基因增加2型糖尿病患者發生急性缺血性腦卒中的風險[13]。Kim等[14]對韓國人群研究發現，在急性缺血性腦卒中伴代謝綜合征病例組TT型基因頻率顯著高于單純急性缺血性腦卒中組及正常對照組，提示MTHFR C677T基因多態性可能與急性缺血性腦卒中患者的患代謝綜合征風險增高有關。本研究發現，MTHFR C677T攜帶T等位基因是腦梗死合并2型糖尿病的危險因素，OR值為2.387。MTHFR C677T基因突變可能與急性缺血性腦卒中合并2型糖尿病易感性相關。

MTHFR C677T基因多態性與急性缺血性腦卒中的TOAST分型之間的相關性目前仍存在爭議。國內外大量研究提示MTHFR C677T基因多態性是急性缺血性腦卒中的危險因素[15-16]，而TT基因型可能導致缺血性腦卒中發生提前。歐洲學者研究發現MTHFR C677T基因突變與歐洲人群LAA相關[17]。MTHFR C677T基因多態性可能是SAO的遺傳危險因子。而我們的研究發現，AIS+DM組T等位基因頻率大于AIS組，但差異無統計學意義。而LAA亞組水平，AIS+DM組T等位基因頻率64.9%大于AIS組的43.8%，差異有統計學意義。因此提示MTHFR C677T基因多態性與腦梗死合并2型糖尿病的TOAST分型的LAA相關。各研究結果的不同可能與地域、人種、研究方法及納入的樣本量大小相關。目前國內外關于MTHFR C677T基因多態性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關性研究尚少。

本研究探討了MTHFR C677T基因多態性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關性，確立MTFHR C677T攜帶T等位基因是缺血性腦卒中合并2型糖尿病的危險因素，發病機制可能與大動脈粥樣硬化有關。此結論尚需大規模臨床研究進一步驗證。