沼液中添加某些活性成分對交鏈孢菌的抑制影響

劉繼紅， 尹 芳， 王昌梅， 趙興玲， 吳 凱， 柳 靜， 楊 紅， 劉士清， 張無敵

(云南師范大學， 云南 昆明 650500)

云南紅豆杉(TaxusyunnanensisCheng et Lu)又名西南紅豆杉，是云南省級珍貴樹種，也是云南省一級重點保護樹種，是中國生產紫杉醇藥物的主要樹種[1-3]。研究發現，云南紅豆杉根、皮、枝葉中含治癌藥物成分紫杉醇等多種治癌藥物成分，含量達0.02%。具有防治癌癥、白血病等特殊療效[4]。但目前由交鏈孢霉屬造成的云南紅豆杉葉片葉斑病現象日趨普遍，影響了樹勢生長及藥用、觀賞價值[5]。

沼液是有機物在進行厭氧消化產生沼氣的同時而得到的一種厭氧產物，含有豐富的營養物質，礦物質、水解酶、B族維生素、氨基酸、植物激素、抗生素和腐殖酸等[6]，是一種良好的有機液體肥料，同時又有殺滅或抑制植物病原菌的作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試病原菌

實驗所用交鏈孢菌由云南農業大學植物病理重點實驗室(該室分離提純并鑒定的菌株)提供。

1.1.2 培養基

實驗室采用常規的PDA培養基[14]。采用馬鈴薯為培養基，配方為：馬鈴薯200 g(去皮切成1 cm 左右的正方體小塊后煮30 min，過濾取清液用)，葡萄糖25 g，瓊脂20 g，加水至1000 mL，不調節pH值。

1.1.3 藥品

葡萄糖，瓊脂粉，腐殖酸，赤霉素，VB1，VB2，VB6及(NH4)2SO4。

1.1.4 儀器

實驗所用主要儀器為：電磁爐、燒杯、玻璃棒、紗布、試管、培養皿、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、無菌打孔器、鑷子、接種環和SW-CJ-1F潔凈工作臺等[14-15]。

1.1.5 供試沼液

取用學校周邊青蒿(Artemisiaannua)為發酵原料經過正常發酵后的沼液。

1.2 方法

1.2.1 沼液的處理方法

將不同來源的沼液經12000 rpm離心1 min后取上清液0.5 mL加入已準備好的培養基表面，涂布均勻后做實驗組，對照組則加入0.5 mL無菌蒸餾水[14-15]。

1.2.2 活性成分處理方法

(1)依次向以青蒿作為發酵原料的沼液內部添加腐殖酸，調節濃度依次為1%,2%,3%,4%,5%,6%。

(2)依次向以青蒿作為發酵原料的沼液內部添加赤霉素，并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(3)依次向以青蒿作為發酵原料的沼液內部添加VB1，并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(4)依次向以青蒿作為發酵原料的沼液內部添加VB2，并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(5)依次向以青蒿作為發酵原料的沼液內部添加VB6，并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(6)依次向以青蒿作為發酵原料的沼液內部添加(NH4)2SO4，調節濃度依次為1%,2%,3%,4%,5%,6%。

1.2.3 數據處理方法

抑制菌絲生長率計算采用生長速率法[14-15]。

抑制數(cm)=對照平板培養基上菌落直徑-處理平板培養基上菌落直徑

抑菌率(%)=

1.2.4 試驗方法

(1)將供試菌種接種于PDA平板培養基上培養至長滿整個平板，放置備用。

(2)不同濃度活性成分的添加：分別向青蒿沼液中添加腐殖酸，赤霉素，VB1，VB2，VB6及(NH4)2SO4。濃度梯度如下：

含腐殖酸的濃度依次為1%,2%,3%,4%,5%,6%；含赤霉素的濃度依次是0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%；含(NH4)2SO4的濃度依次是1%,2%,3%,4%,5%,6%；含VB1、VB2、VB6的濃度依次是0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。加入預先備有培養基的(φ=9 mm)平板中涂布均勻，2個平行，備用，對照組用無菌蒸餾水[14-15]。

(3)抑菌試驗：把調配好的沼液和青蒿原沼液分別采用打孔粘貼法進行抑制交鏈孢菌的實驗，取布滿供試交鏈孢菌的PDA培養基平板，用無菌打孔器(φ=9 mm)取出菌落邊緣生長旺盛的菌絲，用鑷子小心地將菌種塊移入不同抑菌液處理的平板上，菌絲一面朝上，每個培養皿中放入3小塊菌種，并呈三角形放于平板中央，加蓋并標記，放于25℃恒溫培養箱中培養，定時觀察測量不用培養基平板上交鏈孢霉菌的直徑[14,15]。

(4)待培養24 h以后，用十字交叉法測量菌塊生長的大小。之后每天同一時間再對菌塊進行一次測量，一共測量4 d的數據[14-15]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度腐殖酸對沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的沼液里邊添加不同濃度的腐殖酸，復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖1所示。

圖1 不同濃度腐殖酸與沼液抑菌效果的關系

由圖1可以看出，在添加的腐殖酸濃度為1%～2%時，復配液對交鏈孢菌的抑菌效果弱于青蒿原沼液，而當添加的腐殖酸濃度大于2%時，其復配液的抑菌活性強于青蒿原沼液。當添加的腐殖酸濃度介于3%～6%時，隨著病原菌培養時間的增長，青蒿原沼液與復配液之間的抑菌強度差距減小，且當病原菌生長到第4天時，抑菌率都達到了70%。由于腐殖酸對病原菌游動孢子的萌發的抑制效果隨濃度的增加而更顯著[16]，所以得出：高濃度的腐殖酸對病原菌起到抑制生長的作用，低濃度的腐殖酸反而抑菌效果較差。

2.2 不同濃度的赤霉素對沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的沼液里邊添加不同濃度的赤霉素，復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖2所示。

圖2 不同濃度赤霉素與沼液抑菌效果的關系

由圖2可以看出，當添加的赤霉素濃度在0.1%～0.3%時，復配液對交鏈孢菌的抑制作用弱于青蒿原沼液，但當添加赤霉素的濃度在0.4%～0.6%時，復配液的抑菌作用強于青蒿原沼液，隨著添加赤霉素濃度的不斷加大，抑菌效果與原沼液相當。因為赤霉素具有促進細胞分裂和伸長的作用，較低濃度時則表現出刺激病原菌，但濃度較高時則會使細胞死亡。所以可得：高濃度的赤霉素能加強原沼液的抑菌效果，反之低濃度的赤霉素則削弱原沼液的抑菌效果。

2.3 不同濃度的VB1對沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的沼液里邊添加不同濃度的VB1，復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖3所示。

圖3 不同濃度VB1與沼液抑菌效果的關系

由圖3可看出，當添加的VB1的濃度為0.1%時，復配液的抑菌效果強于青蒿原沼液，但是隨著添加的VB1濃度的增大，對交鏈孢菌的抑制作用逐漸減弱。VB1對細胞具有刺激生長的作用，但存在刺激生長的最適濃度0.1%，所以隨著添加濃度的不斷增大至超過最適濃度，復配液對病原菌的抑制作用不斷減弱。由此可以得出：低濃度的VB1對原沼液的抑菌效果有加強的作用，而高濃度的VB1則會削弱青蒿原沼液對交鏈孢菌的抑制效果。

2.4 不同濃度的VB2對沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的沼液里邊添加不同濃度的VB2，復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖4所示。

由圖4可以看出，在添加VB2的濃度在0.1%～0.3%時，復配液的抑菌效果顯著；但當添加的VB2大于0.3%時，隨著VB2濃度的增加，其復配液的抑菌效果趨于平穩。因為VB2對細胞生長代謝起促進作用，但存在促進的最適濃度0.2%，所以在添加濃度不斷增大至超過了最適濃度時，對原沼液的抑菌效果影響越來越不顯著。由以上得出：VB2能夠有效地增加青蒿原沼液的抑菌效果。

圖4 不同濃度VB2與沼液抑菌效果的關系

2.5 不同濃度的VB6對沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的沼液里邊添加不同濃度的VB6，復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖5所示。

由圖5可以看出，當添加VB6的濃度在0.3%時，復配液對交鏈孢菌的抑制效果強于青蒿原沼液；當添加的VB6濃度增加到0.4%時，復配液的抑制作用弱于青蒿原沼液。VB6在細胞蛋白質的合成和分解代謝中起到促進作用，添加低濃度時促進作用較強，導致原沼液的抑菌效果加強，隨著添加濃度的增大，促進作用減弱導致原沼液的抑制效果不顯著。由此得出：低濃度的VB6可以增強原沼液的抑菌效果，反之則降低了原沼液的抑菌效果。

2.6 不同濃度的(NH4)2SO4對沼液抑菌效果的影響

圖6 不同濃度與沼液抑菌效果的關系

綜上可知，在沼液里添加不同濃度的腐殖酸、赤霉素，VB1，VB2，VB6及(NH4)2SO4都對青蒿原沼液抑制交鏈孢菌有不同程度的影響。各活性成分的最適濃度依次是：3%，0.4%,0.1%,0.4%,0.3%,1%。但是低濃度的VB6對原沼液的抑菌效果沒有影響，高濃度的VB6反而削弱了原沼液的抑菌作用。總的來說，青蒿沼液中添加合適濃度的活性成分對抑制交鏈孢菌具有較好的效果。

3 結論

當沼液中添加的腐殖酸濃度為1%～2%時，其復配液對交鏈孢菌的抑制效果弱于青蒿原沼液，但添加腐殖酸的濃度介于3%～6%時，復配液對交鏈孢菌的抑制作用強于青蒿原沼液，并且隨著病原菌培養時間的增強，青蒿原沼液與復配液之間的抑菌效果相當，因此，沼液添加腐殖酸的最適濃度為3%。

當沼液中添加的赤霉素濃度為0.1%～0.3%時，其復配液對交鏈孢菌的抑制效果弱于青蒿原沼液，但是，添加赤霉素濃度介于0.4%～0.6%時，復配液對交鏈孢菌的抑制作用強于青蒿原沼液，但隨著添加的赤霉素濃度的不斷增加，青蒿沼液與復配液之間的抑菌效果相當，因此，沼液添加赤霉素的最佳濃度為4%。

當沼液中添加的VB1濃度為0.1%時，其復配液對交鏈孢菌的抑制效果強于青蒿原沼液，但隨著添加的VB1濃度的增加，復配液的抑菌效果有所減弱，因此，沼液添加VB1的最適濃度為0.1%。

當沼液中添加的VB2濃度為0.1%～0.3%時，其復配液對交鏈孢菌的抑制效果隨著添加的VB2的濃度的增加而增強，但添加的VB2的濃度為0.3%～0.6%時，其復配液的抑菌效果與青蒿原沼液的幾乎相同，因此，沼液里添加VB2的最適濃度為0.3%。

當沼液中添加的VB6濃度小于0.3%時，其復配液對交鏈孢菌的抑制效果幾乎與青蒿原沼液相當，但添加VB6的濃度大于0.4%時，其復配液的抑菌效果又低于原沼液，因此，低濃度的VB6對青蒿原沼液的抑菌效果幾乎無影響，但高濃度的VB6反而會削弱原沼液的抑菌效果。