PP242誘導多囊腎大鼠膽管上皮細胞自噬和凋亡的機制研究

閆文帝，李珍玲，劉特思，李玉姬，原田憲一，任香善,2

(延邊大學1. 腫瘤研究中心、2. 醫學院病理學教研室，吉林 延邊 133002；3. 金澤大學醫學部病理學教研室，日本 金澤 9208640)

Caroli病是一種常染色體隱性遺傳性多囊腎疾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)的肝膽管病變，主要表現為肝內膽管的擴張，常合并門脈高壓及膽道炎癥[1]。目前，其治療手段主要為對癥治療或肝移植，尚無有效的治療方案[2]。多囊腎(polycystic kidney，PCK)大鼠為Caroli病和ARPKD的常用動物模型，是目前為止唯一能夠充分反映多發性膽管囊腫和肝纖維化的動物模型。

PI3K/Akt/mTOR是可以調節細胞增殖、凋亡和自噬的信號通路。研究表明，在乳腺癌、胃癌、肺癌等多種癌癥中異常活化[3-4]。雷帕霉素是經典的mTOR抑制劑，是mTORC1的變構抑制劑，對多種腫瘤有抑制作用[5]。PP242可同時抑制mTORC1和mTORC2，減少負反饋導致的耐藥問題[6]。研究證實，PI3K/Akt/mTOR信號通路中p-Akt、p-mTOR、p-S6等蛋白在ARPKD中呈高表達[7]，提示Akt/mTOR信號通路與ARPKD的發生、發展密切相關。目前為止，尚無PP242對Caroli病的研究報道。本研究旨在闡明mTOR的雙重抑制劑PP242對PCK大鼠膽管上皮細胞增殖、凋亡和自噬的影響，進一步探究其機制，為Caroli病的臨床治療提供新的實驗基礎和理論依據。

1 材料

1.1細胞及組織標本正常和PCK大鼠膽管上皮細胞以及肝組織蠟塊標本均由日本金澤大學病理學教研室提供。

1.2試劑雷帕霉素、PP242購自美國Sigma-Aldrich公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA) 購自Calbiochem公司，用DMSO配制濃縮液，分裝保存于-20℃冰箱；Alexa-488熒光二抗及p-mTOR、p-Akt、Akt、p-4EBP1、4EBP1、LC3、Rictor、Beclin-1抗體，均購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購自美國Abcam公司；ssDNA ELISA 凋亡試劑盒購自Millipore公司。

1.3儀器激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(日本Bay Bioscience公司)；EnVision+system(丹麥DakoCytomation公司)；全波長多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1PCK模型的制備與分組PCK大鼠是Crj:CD(SD)大鼠的PKHD1基因自發突變而來的動物模型，由日本查爾斯河實驗室的Katsuyama等[8]首次報道。2001年，日本金澤大學人體病理學實驗室Sanzen等首次提出PCK大鼠可作為ARPKD，特別是伴有先天性肝纖維化(congenital hepatic fibrosis，CHF)的Caroli病的實驗動物模型。本實驗中使用的正常SD大鼠和PCK大鼠，均購自于日本查爾斯河實驗室，動物實驗的指導原則均按照日本金澤大學實驗動物指南進行。

2.2大鼠膽管上皮細胞的分離與肝組織標本的制備膽管上皮細胞的分離方法如Sato等所述[9]，取8周齡的正常SD大鼠和PCK大鼠，用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液沖洗門靜脈，再向門靜脈內灌注含有0.04%膠原酶和0.22%分散酶的DMEM/F-12培養液靜置20 min，待正常和PCK大鼠膽管上皮細胞分離后，置于含10%胎牛血清、5 μmol·L-1毛喉素、20 μmol·L-1表皮生長因子和1%青-鏈霉素的DMEM/F-12培養液，于37℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養。取10月齡正常和PCK大鼠的肝組織，4%甲醛緩沖液(pH 7.4)浸泡固定，石蠟包埋處理，將蠟塊切成4 μm厚切片，備免疫組化染色用。

2.3免疫組織化學染色采用EnVision法，大鼠組織切片常規脫蠟及水化，梯度乙醇入水，抗原修復用10 nmoL·L-1枸櫞酸鹽檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)微波加熱20 min，p-mTOR(Ser2448)(1 ∶200)和p-Akt(1 ∶25)一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，二甲基聯苯胺(DAB)顯色1～10 min，蘇木精染核1 min，中性樹脂封片。

2.4WST-1比色法PCK大鼠膽管上皮細胞經雷帕霉素(0、0.1、0.5、2 mg·L-1)和PP242(0、0.1、0.5、2 μmol·L-1)處理24、72、120 h后，用WST-1比色法測定。500 nmol·L-13-MA預處理PCK大鼠膽管上皮細胞1 h后，與2 μmol·L-1PP242聯合處理24 h，檢測PP242處理后對膽管上皮細胞增殖的影響。

2.5AnnexinV/PI染色檢測細胞凋亡將細胞接種于35 mm培養皿，待細胞長到70%左右時，用藥組用藥處理24 h，陽性對照組加入200 μmol·L-1的H2O2處理24 h后，常規消化收集細胞，進行Annexin V-FITC和PI染色，流式細胞儀進行檢測。

2.6免疫蛋白印跡實驗PCK大鼠膽管上皮細胞用PP242(0、0.1、0.5、2 μmol·L-1)處理24 h，提取細胞總蛋白，加入蛋白裂解液(T-PER)。蛋白定量后，將40 μg蛋白經梯度膠電泳分離，電轉至PVDF膜上，Akt (1 ∶1 000)、p-Akt (1 ∶1 000)、4EBP1(1 ∶1 000)、p-4EBP1 (1 ∶1 000)、LC3 (1 ∶500)、Rictor (1 ∶1 000)和Beclin-1 (1 ∶500) 4℃孵育過夜，加HRP標記二抗室溫孵育1 h，ECL發光試劑盒顯色，ChemiDOC成像系統拍照，Image J軟件進行結果分析。

2.7免疫熒光染色細胞接種于8孔細胞培養玻片，2 μmol·L-1PP242處理24 h，用4%多聚甲醛固定，用0.1%的Triton X-100處理10 min，血清封閉，LC3抗體(1 ∶200)4℃孵育過夜，DAPI染細胞核，封片后拍照觀察。

2.8LC3、Rictor和Beclin-1基因沉默實驗LC3、Rictor和Beclin-1的siRNA 和陰性對照均購自Qiagen公司，干擾序列見Tab 1。siRNA轉染使用HiPerFect轉染試劑，按試劑盒說明進行操作。PCK大鼠膽管上皮細胞培養24 h后，更換成DMEM/F-12培養液、siRNA (10 nmol·L-1)和3 μL HiPerFect轉染試劑液的混合液，繼續培養72 h。

Tab 1 Interference sequences of LC3, Beclin-1 and Rictor

2.9ELISA檢測ssDNAELISA實驗是根據甲酰胺對凋亡細胞的感受性，選擇性地定量檢測凋亡細胞中的單鏈DNA(single-strand DNA,ssDNA)的檢測方法。PCK大鼠膽管上皮細胞用2 μmol·L-1的PP242處理24 h后，收集細胞上清液，離心后，將樣本按1 ∶100稀釋，微孔加入樣本處理30 min，酶標記抗人IgG抗體處理30 min，加入底物顯色劑15 min(避光)，加入終止液后，用全波長分光光度儀在450 nm處檢測吸光值，統計分析，以大于0.1 IU·L-1為陽性。

2.103D細胞培養將細胞混懸于Matrigel中，細胞均勻接種到24孔板中，待Matrigel凝固后，加入常規培養液培養至d 6，更換含有100 nmol·L-1雷帕霉素和2 μmol·L-1PP242的培養液繼續培養72 h，換液后d 0、3，每個視野選擇3～5個細胞球拍照記錄，并用Image J分別測量d 0、3同一細胞球的直徑，計算增殖率：增殖率/%=(d 3直徑-d 0直徑)×100%。

3 結果

3.1p-mTOR和p-Akt蛋白在PCK大鼠膽管上皮細胞中呈高表達Fig 1大鼠肝組織免疫組化染色結果顯示，p-mTOR和p-Akt蛋白在正常大鼠膽管上皮細胞中呈弱陽性表達，而在PCK大鼠膽管上皮細胞中呈強陽性表達。p-mTOR蛋白陽性顆粒主要位于肝細胞和膽管上皮細胞的細胞核和細胞質，而p-Akt 蛋白主要位于肝細胞和膽管上皮細胞的細胞核。

3.2雷帕霉素和PP242對膽管上皮細胞增殖的影響正常和PCK大鼠膽管上皮細胞分別用0、0.1、0.5、2 mg·L-1的雷帕霉素和0、0.1、0.5、2 μmol·L-1的PP242處理24、72、120 h后發現，與對照組相比，雷帕霉素和PP242藥物處理后的膽管上皮細胞的增殖受到明顯抑制，且呈濃度依賴性(P<0.05)。在同一時間、同一濃度下，PP242比雷帕霉素的抗增殖效果更明顯(Fig 2A、2B)。

Fig 1 Expression of p-mTOR and p-Akt in bile duct epithelial cells examined by immunohistochemistry (×200)

3.3雷帕霉素和PP242下調PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達不同濃度的雷帕霉素和PP242處理PCK大鼠膽管上皮細胞24 h后，p-Akt和p-4EBP1的蛋白表達水平隨著藥物濃度的增高而降低，且在2 μmol·L-1時抑制效果最為明顯。在相同濃度作用下，PP242對磷酸化Akt和4EBP1的抑制效果更明顯(Fig 2C、2D)。

3.4PP242誘導PCK大鼠膽管上皮細胞凋亡流式細胞術結果顯示，PP242組細胞凋亡率明顯高于對照組(Fig 3A)。ssDNA ELISA實驗結果顯示，PP242組細胞凋亡率明顯高于對照組(Fig 3B)。蛋白印跡實驗結果顯示，cleaved caspase-3表達明顯上調(Fig 3C)。以上結果提示，PP242可誘導PCK大鼠膽管上皮細胞凋亡。

3.5PP242誘導PCK大鼠膽管上皮細胞自噬蛋白免疫印跡結果顯示，0、0.1、0.5、1、2 μmol·L-1PP242作用于PCK大鼠膽管上皮細胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，自噬標識蛋白LC3-II/ LC3-I的比值以及Beclin-1呈逐漸升高的趨勢，表明PP242能誘導PCK大鼠膽管上皮細胞發生自噬，且呈濃度依賴性(Fig 3D)。免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，2 μmol·L-1PP242處理組細胞胞質中LC3綠色熒光顆粒含量明顯增多，熒光強度也明顯增強(Fig 3E)。

Fig 2 Effect of rapamycin and PP242 on viability of bile duct epithelial cells and protein level of PI3K/Akt/mTOR signal pathway n=3 )

A, B: The effect of rapamycin (mg·L-1) and PP242 (μmol·L-1) on proliferation in bile duct epithelial cells detected by WST-1 assay;*P<0.05vs24 h control;#P<0.05vs72 h control;△P<0.05vs120 h control. C，D: The effect of rapamycin and PP242 on the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes detected by Western blot.*P<0.05vscontrol.

3.6mTOR抑制劑抑制PCK大鼠膽管上皮細胞成球能力3D細胞培養結果顯示，PP242組在處理72 h后，與對照組相比，細胞成球能力明顯受到抑制(Fig 4A、4B)。蛋白印跡結果顯示，Rictor基因沉默后其蛋白表達水平明顯下調(Fig 4D)。為進一步探尋mTORC2對細胞生長的抑制作用，使用小干擾RNA處理mTORC2復合物Rictor，結果發現，Rictor基因沉默對PCK大鼠膽管上皮細胞成球能力并未產生明顯影響，但當與雷帕霉素聯合作用時，細胞的成球能力明顯受到抑制(Fig 4C、4E)。提示mTORC1和mTORC2共同抑制可明顯降低PCK大鼠膽管上皮細胞的成球能力，mTORC1/C2抑制劑PP242可明顯抑制膽管上皮細胞的增殖。

3.7LC3、Beclin-1siRNA和3-MA可逆轉PP242對PCK大鼠膽管上皮細胞增殖的抑制效應為了觀察PP242抑制膽管上皮細胞增殖過程中自噬的作用，使用LC3和Beclin-1基因沉默方法及自噬抑制劑3-MA后，檢測PP242對PCK大鼠膽管上皮細胞增殖的影響。LC3基因沉默效果用免疫熒光染色方法鑒定，結果顯示，LC3基因沉默后，細胞質內的綠色熒光顆粒明顯減少(Fig 5A)。Beclin-1基因沉默后，用蛋白印跡方法鑒定，結果顯示，Beclin-1基因沉默后其表達明顯下調(Fig 5B)。

LC3和Beclin-1 siRNA對PCK大鼠膽管上皮細胞活力的影響甚微，而與PP242共同處理可明顯增加細胞增殖活力(P<0.05)，見Fig 5C、5D。單獨使用0.5 μmol·L-13-MA時，對大鼠膽管上皮細胞活力的影響甚微，但3-MA與PP242共同處理后，減弱PP242對細胞活力的抑制效果(P<0.05)，見Fig 5E。上述結果提示，PP242誘導的自噬是抑制PCK膽管上皮細胞生長的主要機制之一。

Fig 3 Effect of PP242 on apoptosis and autophagy of PCK rat cholangiocytes

A: The effect of PP242 (μmol·L-1) on apoptosis detected by Annexin V/PI double staining; B: The effect of PP242 on apoptosis detected by ELISA; C: The expression of cleaved caspase-3 increased in the PCK rat cholangiocytes treated with PP242; D: The bile duct epithelial cells treated with different concentrations of PP242 and rapamycin (mg·L-1) for 24 h, the level of Beclin-1 and the ratio of LC3-II/LC3-I increased; E: The protein expression of LC3 increased in PCK rat cholangiocytes treated with PP242 (immunofluorescence staining, ×400).*P<0.05vscontrol.

4 討論

Caroli病，即先天性肝內膽管擴張癥，其病因不明，在病情進展中出現多種并發癥，且7%左右的患者可發展為膽管癌[10]，目前臨床上尚無有效的治療方案。PI3K/Akt/mTOR信號通路是與細胞增殖、凋亡和自噬相關的信號通路[11]。本研究發現，p-Akt和p-mTOR蛋白的表達水平在PCK大鼠膽管上皮細胞中明顯增高，提示Akt/mTOR信號通路的異常活化是導致PCK大鼠膽管上皮細胞過度生長的機制之一。

雷帕霉素是一種對mTORC1有效的mTOR抑制劑，但對mTORC2不敏感。當使用雷帕霉素時，mTORC2磷酸化Akt 473位點，負反饋激活PI3K/Akt/mTOR通路，導致部分患者在應用雷帕霉素數月后發生復發和耐藥，使雷帕霉素在臨床的應用受到限制[12]。PP242是一種ATP競爭性mTORC1/2雙重抑制劑，其主要靶點是mTORC2，可同時抑制mTORC1和mTORC2。Qin等[13]研究發現，PP242可通過誘導凋亡和自噬抑制卵巢癌細胞的生長。本研究發現，PP242和雷帕霉素兩者均可抑制PCK大鼠膽管上皮細胞的增殖，且呈時間-濃度依賴性，其機制是下調PI3K/Akt/mTOR下游蛋白p-Akt和p-4EBP1的表達。而同等濃度下，PP242的抑制效果明顯強于雷帕霉素。在PP242處理膽管上皮細胞后，其成球能力明顯減弱。我們研究發現，單用雷帕霉素對細胞成球能力影響甚微，而Rictor基因沉默與雷帕霉素聯用后，細胞成球能力明顯受到抑制。提示mTORC1和mTORC2的共同抑制與mTORC1單獨抑制相比，其抑制膽管上皮細胞增殖的能力更明顯。

Fig 4 Effect of PP242 and Rictor gene silencing and rapamycin on ability of cell formation(×400)

A, B: The effects of rapamycin(100 nmol·L-1), Rictor siRNA and with rapamycin on bile duct epithelial cells spheroid formation examined for PCK cholangiocytes using three-dimensional cell culture system, PP242(2 μmol·L-1) significantly inhibited cystic growth of PCK cholangiocytes; C, E: Knockdown of Rictor with siRNA of PCK cholangiocytes treated with rapamycin significantly decreased the bile duct epithelial cells spheroid formation. D: The results of Western blot showed the silencing of Rictor for 72 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsRictor siRNA.

Qu等[14]研究發現，PP242可誘導急性骨髓性白血病小鼠的白血病細胞凋亡。本研究發現，PP242處理后，細胞凋亡數量明顯增多，凋亡相關蛋白clevead caspase-3的表達隨著藥物濃度的升高而升高。提示PP242可誘導PCK大鼠膽管上皮細胞的凋亡。

Jin等[15]研究發現，當細胞發生自噬時，LC3-I與磷脂酰乙醇胺共價結合后轉變為LC3-II，進一步結合在自噬體膜上，因此，當LC3-II/LC3-I比值增高時說明細胞產生了自噬。本研究發現，PP242處理后，LC3-II/LC3-I的比值增高，細胞內LC3綠色免疫熒光顆粒表達增多，提示PP242處理后可誘導PCK大鼠膽管上皮細胞自噬。為了進一步探討PP242誘導PCK大鼠膽管上皮細胞自噬的機制，我們觀察了LC3、Beclin-1基因沉默和自噬抑制劑3-MA對細胞增殖活力的影響。研究發現，LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA本身對細胞增殖影響甚微，但其與PP242聯用后，可明顯逆轉PP242對細胞增殖的抑制作用，提示誘導細胞自噬是其抑制膽管上皮細胞生長的主要機制之一。提示PP242可誘導PCK大鼠膽管上皮細胞生長抑制，其機制與誘導細胞自噬相關。

綜上所述，與單獨雷帕霉素相比，mTORC1/2抑制劑PP242對PCK大鼠膽管上皮細胞生長抑制效果更明顯，其機制與誘導凋亡和自噬相關。提示PP242有望成為Caroli病的治療藥物，并有待更進一步的探究。

Fig 5 Effects of LC3 siRNA, Beclin-1 siRNA and 3-MA on proliferation of PCK rat cholangiocytes inhibited by PP242

A: The results of immunofluorescence showed the silencing of LC3 for 72 h; B: The results of Western blot showed the silencing of Beclin-1 for 72 h; C, D: The effect of LC3 siRNA or Beclin-1 siRNA for 72 h and PP242 (μmol·L-1) for 48 h together on the proliferation of the cholangiocytes detected by WST-1 assay.*P<0.05,**P<0.01vsnegative siRNA and PP242; E: The effect of 3-MA (500 nmol·L-1) and PP242 together for 48 h on the proliferation of cholangiocytes detected by WST-1 assay.#P<0.05vsPP242.