酪氨酸羥化酶與鉤藤堿抑制甲基苯丙胺依賴小鼠條件性位置偏愛的關(guān)系研究

朱 晨，劉 偉，李 璟，李 嬋，房 淼，陳志杰，周玉婷，羅超華，莫志賢

(南方醫(yī)科大學(xué)1. 中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)教研室、2. 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

鉤藤具有清熱平肝、息風(fēng)止痙的功效，是治療頭痛眩暈、驚癇抽搐、妊娠子癇等病證的常用中藥[1]。鉤藤主要含生物堿、黃酮、三萜類等，其中鉤藤堿含量約占總堿的34.5%～51.0%，為其主要有效成分，具有降血壓、鎮(zhèn)靜、抗血小板聚集和抗血栓形成的作用[2]。本團(tuán)隊(duì)初期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿具有抑制甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)引起的條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)的作用。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是多巴胺合成的限速酶，它是控制運(yùn)動(dòng)和獎(jiǎng)勵(lì)相關(guān)行為的重要物質(zhì)[3-4]。本文旨在探索鉤藤堿對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠CPP的作用，應(yīng)用蛋白免疫印跡和免疫組化法檢測(cè)TH的表達(dá)，進(jìn)一步闡明鉤藤堿對(duì)METH依賴小鼠CPP的分子作用機(jī)制。

1 材料

1.1藥品與試劑鹽酸甲基苯丙胺，購(gòu)自國(guó)家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：1212-9802；鉤藤堿，購(gòu)自日本MATSUURA YKUGYO 公司；鹽酸氯胺酮注射液(規(guī)格：2 mL:0.1 g)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)；三卡因甲磺酸鹽(MS222)，購(gòu)自Sigma公司; 抗TH抗體(AB152)，購(gòu)自Millipore公司。

1.2儀器Noldus EthoVision XT 8.5軟件(荷蘭Noldus公司)；ChemiImager 550凝膠成像儀(美國(guó)Alpha Innotech公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，♀♂各半，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2011-0015。

2 方法

2.1CPP箱的制作CPP箱由兩個(gè)長(zhǎng)15 cm，寬15 cm，高15 cm的箱體組成，其中一箱體涂成黑色，另一箱體涂成白色；兩箱體之間由一透明活動(dòng)擋板分隔開，當(dāng)透明擋板抽開時(shí)，小鼠可在兩箱體間自由活動(dòng)[5]。

2.2小鼠基線測(cè)定實(shí)驗(yàn)前，將小鼠放于抽出擋板的CPP箱中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行小鼠位置偏愛測(cè)試。測(cè)試前將擋板抽出，小鼠放置于兩箱體中間，記錄小鼠在15 min內(nèi)在黑白箱中的活動(dòng)時(shí)間(以頭部為準(zhǔn))。結(jié)果表明，自然狀態(tài)下，>90%的小鼠偏愛黑箱，因此，將黑箱選為偏愛箱，白箱選為伴藥箱。小鼠篩選以在黑箱中的活動(dòng)時(shí)間>8 min為合格。

2.3CPP模型的復(fù)制與給藥取基線測(cè)定合格的小鼠50只，隨機(jī)分成5組，分別為：空白對(duì)照組、模型組、鉤藤堿低劑量組(40 mg·kg-1)、鉤藤堿高劑量組(80 mg·kg-1)、氯胺酮組(15 mg·kg-1)。d 1,記錄小鼠15 min內(nèi)在CPP箱中的活動(dòng)。d 2～5，模型組和給藥組每天上午8 ∶00皮下注射METH 4 mg·kg-1(對(duì)照組注射同體積生理鹽水)，之后放入伴藥箱中訓(xùn)練1 h；鉤藤堿組從d 3開始，在注射METH前30 min，灌胃相應(yīng)劑量的鉤藤堿；氯胺酮組從d 3開始，在注射METH之前15 min，腹腔注射氯胺酮(15 mg·kg-1)；各組下午4 ∶00給予生理鹽水(0.15 mL，sc)后，放入黑箱中訓(xùn)練1 h，連續(xù)4 d。d 6即末次給藥24 h后，記錄各組小鼠在CPP箱中15 min 內(nèi)的活動(dòng)。

2.4免疫組化法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)TH的表達(dá)行為學(xué)測(cè)定完成后，處死小鼠，取腦組織，于4%多聚甲醛中固定24 h。腦組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片，厚度約5 μm,用防脫載玻片撈起，進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化。按常規(guī)免疫組化法進(jìn)行TH免疫組化染色，一抗為TH(1 ∶100)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，陰性對(duì)照則用PBS液代替一抗。結(jié)果判定陽(yáng)性表達(dá)為胞膜和(或)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒染色，若無棕黃色顆粒則為陰性。

2.5Westernblot檢測(cè)TH的表達(dá)行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，將小鼠處死，取出小鼠的腦組織，加入RIPA裂解液和PMSF(50 ∶1)，進(jìn)行超聲勻漿提取組織蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，參考之前的文獻(xiàn)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。一抗為TH(1 ∶100)，以β-actin為內(nèi)標(biāo)；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)。用ChemiImager 550凝膠成像儀采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個(gè)條帶的積分光密度(IOD)值。

3 結(jié)果

3.1小鼠訓(xùn)練前后在伴藥箱的活動(dòng)時(shí)間變化用Noldus EthoVision XT8.5軟件，分析訓(xùn)練前后小鼠在伴藥箱中的停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)軌跡，比較訓(xùn)練前后各組小鼠在伴藥箱中活動(dòng)時(shí)間的差值(小鼠訓(xùn)練后在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間-小鼠訓(xùn)練前在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間)。由Tab 1可見，與空白組相比，注射METH 4 mg·kg-1后，模型組小鼠在伴藥箱中停留時(shí)間明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組小鼠在伴藥箱中的停留時(shí)間明顯減少(P<0.01)。各組小鼠造模前后在CPP箱的運(yùn)動(dòng)路線圖見Fig 1。

3.2TH蛋白免疫組化結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值，取其平 均值作為該組各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)含量。如Fig 2所示，

Tab 1 Change of activity time of mice in non-preferred compartment by injection of methamphetamine

**P<0.01vscontrol group;##<0.01vsmodel group

Fig 1 Road maps of mice in CPP compartment

A: Control group before modeling; B: Control group after modeling; C: Methamphetamine model group before modeling; D: Methamphetamine model group after modeling; E: Rhynchophylline low-dose group before modeling; F: Rhynchophylline low-dose group after modeling; G: Rhynchophylline high-dose group before modeling; H: Rhynchophylline high-dose group after modeling; I: Ketamine group before modeling; J: Ketamine group after modeling.

與對(duì)照組相比，經(jīng)過CPP訓(xùn)練后，模型組小鼠海馬區(qū)中TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，給予鉤藤堿干預(yù)后，小鼠海馬區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.01)。

3.3TH蛋白的westernblot分析結(jié)果如Fig 3所示，小鼠腦內(nèi)的TH表達(dá)IOD值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦內(nèi)的TH表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組小鼠腦內(nèi)的TH表達(dá)明顯減少(P<0.01)。

Fig 2 Micrographs of TH positive cells in hippocampus of mice n=10)

1: Control group; 2: Model group of methamphetamine; 3: Low-dose of rhynchophylline group; 4: High-dose of rhynchophylline group; 5: Ketamine group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

Fig 3 Expression of TH of mice by western n=3)

1: Control group; 2: Model group of methamphetamine; 3: Low-dose of rhynchophylline group; 4: High-dose of rhynchophylline group; 5: Ketamine group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

4 討論

METH為白色透明不規(guī)則晶體，俗稱“冰毒”，1919年由日本科學(xué)家首次合成，其特點(diǎn)為見效快、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。國(guó)家禁毒辦公布的《2017年中國(guó)禁毒報(bào)告》顯示，2016年繳獲各類毒品82.1噸，其中冰毒晶體17.4噸，位于榜首。METH有很強(qiáng)的中樞興奮作用，極易成癮，且復(fù)吸率高。

CPP實(shí)驗(yàn)是一種常用的藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)以及藥物渴求研究的動(dòng)物模型，是評(píng)估藥物依賴精神依賴性最方便、最常用、最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。人為地將藥物與動(dòng)物先天的非偏愛側(cè)相聯(lián)系，通過對(duì)比動(dòng)物在非偏愛側(cè)停留時(shí)間的長(zhǎng)短，判斷藥物精神依賴性的強(qiáng)弱[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，給予METH 4 mg·kg-1后，模型組小鼠在伴藥箱中的時(shí)間明顯增加，說明注射METH 4 mg·kg-1可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CPP效應(yīng)。與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組(40、80 mg·kg-1)小鼠在伴藥箱中的逗留時(shí)間明顯減少，表明低、高劑量鉤藤堿對(duì)METH依賴小鼠CPP具有一定的抑制作用。

藥物成癮的機(jī)制十分復(fù)雜，與腦內(nèi)多種蛋白質(zhì)表達(dá)和結(jié)構(gòu)功能改變有關(guān)。 TH在兒茶酚胺生物合成過程中至關(guān)重要，是其中最重要的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記酶，與藥物依賴獎(jiǎng)賞通路密切相關(guān)。研究表明，與正常組相比，給予苯丙胺50 mg·kg-1,可使斑馬魚端腦區(qū)TH mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)[7];斑馬魚腹腔注射40 mg·kg-1METH 3次后，其腦內(nèi)TH蛋白的表達(dá)明顯增加[8]。腹腔注射METH(2.5、10 mg·kg-1)7 d后，小鼠紋狀體中TH蛋白的表達(dá)，以及黑質(zhì)TH基因表達(dá)水平和TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少[9]。將TH-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(頭部熒光)浸泡在濃度為0.6 mg·L-1METH中，轉(zhuǎn)基因斑馬魚頭部熒光明顯增強(qiáng)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，給予METH 4 mg·kg-1后，METH依賴小鼠腦內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及TH蛋白的表達(dá)明顯增加；給予鉤藤堿干預(yù)后，小鼠腦內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和TH蛋白表達(dá)明顯減少，表明TH與鉤藤堿抑制METH引起的CPP效應(yīng)有關(guān)，是動(dòng)物行為學(xué)改變的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一。

鉤藤堿是中藥鉤藤的主要活性成分，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿能抑制苯丙胺類物質(zhì)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生CPP，抑制苯丙胺所致大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化和大鼠伏隔核、杏仁核中NR2B蛋白表達(dá)的變化[11-12]。鉤藤堿可抑制METH引起的大鼠伏隔核內(nèi)GluR2/3亞基蛋白表達(dá)上調(diào)，以及下丘腦內(nèi)GluR2/3亞基蛋白表達(dá)下調(diào)[13]。鉤藤堿(60 mg·kg-1)可抑制METH依賴大鼠海馬CA1區(qū)和紋狀體中p-CREB、c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加的趨勢(shì)，使p-CREB及c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)恢復(fù)正常[14]。

本研究表明，鉤藤堿具有抑制METH依賴小鼠CPP的作用，這種作用可能與降低小鼠腦內(nèi)TH蛋白的表達(dá)有關(guān)。由于藥物成癮的發(fā)生與發(fā)展極其復(fù)雜，關(guān)于鉤藤堿調(diào)控TH的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。