枸杞多糖通過Akt/eNOS通路減輕LPS致ARDS小鼠肺損傷

李 雯，陳 蘭，戚 迪，王導新

(重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科，重慶 400010)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是臨床常見的危重病，臨床表現為呼吸窘迫、頑固性低氧血癥以及呼吸衰竭，其發病機制錯綜復雜，仍未完全闡明。雖診療技術日益提高，但ARDS患者的病死率仍居高不下[1-2]。目前認為，級聯性炎癥反應爆發、肺微血管內皮細胞及屏障損傷導致的通透性肺水腫，是ARDS發生、發展中的重要環節[3]。因此，如何抑制炎癥及減輕肺微血管內皮損傷，對ARDS的治療及預后有重要意義。

枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide, LBP)是由我國傳統中藥枸杞提取的一種水溶性多糖，該多糖被明確為蛋白多糖，由木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖及阿拉伯糖組成，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、調節免疫等作用[4]。有研究表明，LBP可通過調控PI3K/Akt/eNOS通路，對大鼠心肌發揮保護性作用[5]。我們前期實驗證實，Akt/eNOS信號通路參與介導小鼠ARDS肺血管內皮屏障保護效應[3]，但目前國內外尚無LBP與ARDS的關聯報道。本研究旨在通過構建脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)致ARDS小鼠模型，探討LBP介導的Akt/eNOS信號通路對小鼠ARDS的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物32只6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠，♂，體質量(20.0±2.0)g，由重慶醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0001。飼養于重慶醫科大學動物實驗中心，動物研究方案由重慶醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審核批準。

1.2試劑LBP(Solarbio公司，純度≥90%，批號：SP9311)；LPS來源Escherichiacoli055:B5(Solarbio公司，批號：L8880)；LY294002(Selleck公司，批號：S1105)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)及白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)ELISA試劑盒(聯科生物有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標記熒光檢測法，通用型)購自凱基生物技術有限公司；β-actin、Akt、p-Akt抗體(Bioworld公司)；內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、p-eNOS抗體(Abcam公司)；cleaved caspase-3抗體(萬類生物公司)；ECL檢測試劑盒(凱基生物技術有限公司)。

1.3儀器DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，Z233MK-2型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)，Synergy HT 多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)，超微量紫外可見分光光度計(中國百泰克生物技術有限公司)，TE2000-U倒置顯微鏡(日本尼康公司)，Gel Doc2000型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4方法

1.4.1ARDS小鼠模型的制備 將小鼠隨機分為對照組(control組)、模型組(LPS組)、LBP+LPS組(LBP組)和LY294002+LBP+LPS組(LY294002組)，每組8只。小鼠稱重后，腹腔注射4%水合氯醛(6 mg·kg-1)麻醉小鼠，LPS組、LBP組及LY294002組小鼠通過氣管插管按5 mg·kg-1劑量滴注無菌LPS，建立ARDS模型。 LBP組及LY294002組于LPS注射前2 h給予LBP(200 mg·kg-1)灌胃，LY294002組在LPS滴注前1 h頸靜脈注射Akt抑制劑LY294002(40 mg·kg-1)，其余組給予等體積生理鹽水。LPS滴注24 h后，4%水合氯醛麻醉，并放血處死小鼠。

1.4.2肺組織HE染色及病理評分 取左下肺組織，4%多聚甲醛固定72 h，切成5 μm石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。肺損傷評分標準：肺泡及間質出血；肺水腫；肺泡腔或間質炎性細胞浸潤或聚集；肺泡壁增厚和/或透明膜形成。根據病變輕重評分：0分為無損傷；1分為輕度病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變。總評分為上述各項評分分數總和[6]。

1.4.3肺濕干比(W/D) LPS滴注24 h后處死小鼠，取新鮮右肺組織，稱重，即肺濕重(W)，再置于80℃恒溫箱72 h后，稱重，即干重(D)，計算肺W/D值。

1.4.4小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)蛋白及炎癥因子的檢測 LPS滴注24 h后，以1 mL無菌PBS緩沖液反復灌洗肺泡3次，確保回收率大于80%。4℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白含量；ELISA法檢測TNF-α、IL-1β含量。

1.4.5小鼠肺組織MDA及SOD的檢測 取右肺組織，肺組織重量按重量(g) ∶體積(mL)=1 ∶9加入0.9%生理鹽水，冰水浴條件下，機械勻漿，制備10%的勻漿液，4℃、2 500～3 500 r·min-1離心10 min，取上清液。BCA法測樣本蛋白濃度，根據MDA、SOD檢測試劑盒說明書操作，分光光度計分別測定波長532 nm及550 nm處吸光度值。計算公式：肺組織MDA活性=(測定OD-對照OD)/(標準OD-空白OD)×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度；肺組織總SOD活性=(對照OD-測定OD)/對照OD÷50%×反應液總體積/取樣量÷待測樣本蛋白濃度。

1.4.6生物素標記TUNEL檢測小鼠肺組織凋亡 取右上肺組織，卡諾氏液固定，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，按TUNEL試劑盒要求操作：石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS漂洗后，每個樣本滴加100 μL 1×Proteinase K工作液，37℃濕盒反應20 min，PBS漂洗后，加50 μL連Streptavidin-HRP工作液，37℃濕盒反應60 min(注意避光)，PBS漂洗后，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察拍照。每組選2張切片，每張切片隨機選取5個完整的高倍視野(×400)，計數200個細胞中的TUNEL染色陽性細胞數，計算凋亡指數(apoptotic index, AI)：AI/%=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.4.7Western blot檢測肺組織凋亡蛋白cleaved caspase-3及p-Akt、p-eNOS蛋白的表達 將肺組織按每100 mg加入1 mL RIPA裂解液，冰上充分勻漿，裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，加1/4體積的5×loading buffer，混勻，100℃煮10 min。BCA法測定蛋白濃度，按30 μg蛋白/泳道上樣，行聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，濕轉法轉移至PVDF膜，含5%脫脂奶粉或BSA的TBST封閉液室溫搖床封閉1 h,加入對應一抗，4℃冰箱過夜，加入HRP標記的二抗，37℃恒溫箱孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統掃描成像，Quantity One軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1LBP對LPS誘導的小鼠肺組織損傷的影響及LY294002的作用如Fig 1所示，對照組肺組織結構完整，肺泡間隔均一，無增寬，未見出血、水腫及炎性細胞浸潤；LPS組肺組織損傷明顯，肺泡間隔增厚明顯，肺泡出血、伴大量水腫液及炎性細胞浸潤；LBP組肺泡間隔輕度增寬，伴輕度出血、水腫及炎癥細胞浸潤；LY294002組與LPS組病理改變類似，但程度較輕。

2.2LBP對LPS誘導的小鼠W/D的影響及LY294002的作用Tab 1結果顯示，與對照組比 較，LPS組、LBP組、LY294002組的W/D值均明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)；LBP干預后，W/D值較LPS組及LY294002組明顯降低(P<0.05)，LY294002組W/D值介于LBP組與LPS組之間。

Tab 1 Comparison of W/D in lungs, and total protein, inflammatory cytokines in BALF of mice in each

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS;△P<0.05vsLBP

Fig 1 Pathological changes in lung tissues (×400)

A: Control group; B: LPS group; C: LBP group; D: LY294002 group; E: The lung injury scores in mice.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsLBP group.

2.3LBP對LPS誘導的小鼠BALF蛋白含量、TNF-α、IL-1β含量的影響及LY294002的作用與對照組比較，LPS組、LBP組及LY294002組小鼠BALF中蛋白含量、TNF-α及IL-1β含量均明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；LBP干預后，BALF中蛋白含量、TNF-α及IL-1β含量明顯降低(P<0.05)；LY294002拮抗后，各項指標均明顯增加(P<0.05)。見Tab 1。

2.4LBP對LPS誘導的小鼠肺組織MDA、總SOD的影響及LY294002的作用Tab 2結果顯示，與對照組比較，LPS組、LBP組及LY294002組小鼠肺組織MDA含量明顯增加，SOD活性明顯下降(P<0.05)；LBP干預后，小鼠肺組織MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增高(P<0.05)；LY294002拮抗后，MDA含量明顯增高，SOD活性明顯降低(P<0.05)。

Tab 2 Comparison of levels of MDA and SOD in lung tissues of each group

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS;△P<0.05vsLBP

2.5LBP對LPS誘導的小鼠肺組織中細胞凋亡的影響及LY294002的作用如Fig 2所示，對照組中觀察到極少數的TUNEL陽性細胞，而LPS組、LBP組及LY274002組小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞明顯增加，AI明顯升高(P<0.05)；LBP干預后，小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞及AI明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6LBP對LPS誘導的小鼠肺組織cleavedcaspase-3、p-Akt、p-eNOS蛋白表達的影響及LY294002的作用Fig 3的Western blot結果顯示，與對照組比較，LPS組、LBP組及LY294002組小鼠肺組織cleaved caspase-3蛋白水平又明顯增高(P<0.05)，p-Akt、p-eNOS蛋白水平明顯降低(P<0.05)；LBP干預后，cleaved caspase-3水平明顯降低，p-Akt、p-eNOS蛋白水平明顯增高(P<0.05)；LY294002拮抗后，p-Akt、p-eNOS蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

3 討論

ARDS是指由各種肺內外致病因素所導致的急性彌漫性肺損傷，進而發展的急性呼吸衰竭，主要病 理特征為廣泛的肺部炎癥、肺血管內皮細胞損傷及肺微血管通透性增高導致的滲透性肺水腫[3]。因此，有效抑制肺部炎癥反應，同時減輕肺微血管內皮屏障功能損傷，是降低ARDS患者病死率的有效治療手段。

Fig 2 Representative images of TUNEL staining of lung tissues(×400)

A: Control group; B: LPS group; C: LBP group; D: LY294002 group; E: Quantitative analysis of the number of apoptosis index.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsLBP group.

研究證實，LBP可通過抑制肝細胞TNF-α、IL-1及MDA含量，緩解四氯化碳誘導的急性肝損傷[7]，且可有效逆轉由N-甲基-D天門冬氨酸誘導損傷的大鼠視網膜組織中eNOS表達下調[8]。研究還發現，LBP可作為一種新型抗氧化劑，激活PI3K/Akt/Nrf2信號通路，減輕高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗[9]。

本實驗通過氣管插管滴注LPS建立內源性小鼠ARDS模型，結果顯示，LBP能有效抑制LPS誘導的小鼠急性肺損傷病理改變，并減輕肺水腫及BALF蛋白含量，說明LBP可以減輕ARDS時肺損 傷，并改善肺微血管通透性。炎癥細胞在ARDS的發生、發展中發揮重要作用，活化的內皮細胞炎癥反應可誘導中性粒細胞激活、氧自由基形成、炎癥介質釋放等，導致肺微血管屏障功能損傷，肺微血管通透性增加，最終加重肺損傷[10]。本實驗中，LBP能明顯降低BALF中TNF-α及IL-1β含量，提示LBP能通過抑制炎癥反應，對LPS誘導的ARDS發揮保護作用。研究表明，LPS等損傷性因素引起的肺損傷，引起氧自由基釋放，可產生大量脂質過氧化物，進一步破壞細胞膜的結構和功能，導致肺毛細血管通透性增加，加重肺水腫的發生[11]。本實驗中，LBP干預能明顯降低肺組織MDA的水平，并增加SOD活性，提示LBP可抑制氧化應激反應，改善抗氧化能力，緩解急性肺損傷。

Fig 3 Expression of cleaved caspase-3, p-Akt, p-eNOS in lung tissues of mice by Western blot (A) and relative protein expression(B) n=8)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsLBP group

研究表明，肺微血管內皮細胞凋亡將導致肺微血管完整性受損，進而導致肺微血管通透性增高，加重肺損傷，其中cleaved caspase-3的出現，標志著細胞死亡已進入不可逆階段[12-13]。本實驗發現，LBP可明顯降低肺內皮細胞的凋亡，以及凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達，提示LBP可抑制凋亡反應，改善肺內皮屏障功能障礙，減輕肺損傷。

Akt相關信號通路在細胞生存、增殖、分化、遷移等細胞功能中發揮重要的調節作用，是機體應對各種有害刺激的一種重要補償機制[14-15]，其中，eNOS是Akt重要的下游靶點，在調節血管生長及內皮功能中發揮重要作用[2]。本課題組前期實驗亦證實，Akt/eNOS信號通路參與網膜素介導的內皮屏障保護效應。在本實驗中，LBP干預可明顯提高ARDS小鼠肺組織Akt及eNOS蛋白的磷酸化水平，而Akt抑制劑LY294002能明顯下調小鼠肺組織Akt及eNOS蛋白磷酸化水平，并阻斷LBP的保護效應。提示LBP對ARDS小鼠肺損傷的保護作用，部分機制可能是通過調控Akt/eNOS信號通路。

綜上所述，LBP可通過介導抗炎、抗氧化應激及抗凋亡作用，緩解ARDS肺微血管內皮屏障損傷，其機制可能與Akt/eNOS信號通路的激活有關。同時，由于ARDS發病機制錯綜復雜，LBP對ARDS的保護作用是否涉及其他信號通路，仍需進一步探討。