葉綠素對乳酸鏈球菌生長特性和代謝水平的影響

李媛媛，歐雅文，崔羽，胡小松，廖小軍，張燕

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，北京100083）

隨著生活水平提高，居民高脂肪、高蛋白飲食的 攝入使肥胖、高血脂等代謝疾病的發病率在全世界普遍上升[1－3]。為了降低肥胖發生率，緩解這一健康問題，2016年美國農業部和中國營養學會分別修訂了各自的膳食指南，指南中均明確提出增加蔬菜的攝入量[4－7]。葉綠素作為綠色蔬菜中含量最為豐富的色素，其決定了果蔬的品質特征，同時國內外研究發現其還具有降低膽固醇、調節腸道功能、抗突變等生理功能[8-11]。近年來，隨著深色蔬菜中的花色苷、多酚等非營養物質被深入研究，蔬菜攝入后的葉綠素的生物活性和營養價值引起了研究人員的重視，但目前人們對葉綠素的生物活性作用的理解還十分有限。

乳酸菌（Lactobaillus）是在自然界中廣泛存在的一類可以發酵碳水化合物產乳酸的菌群，也是最早被利用于食物加工貯藏中的微生物之一[12]。Park等[13]研究發現微生物在體內作用的靶點為胃腸道，因此它對腸道菌群具有直接的調控作用。最新的研究表明在人體腸道菌群中乳酸菌具有改善腸道菌群結構、調節腸道菌群平衡、促進機體最大程度吸收營養物質，提高機體免疫力等有益的功能[13-14]。當給肥胖人群補充乳酸菌時，乳酸菌對肥胖人群腸道菌群的調節平衡作用，能夠潛在的治療肥胖及腎臟疾病[15]。在腸道中，乳酸菌通過產生的有機酸維持腸道酸性環境的穩定，并抑制有害菌的生長[16]。

因此，本試驗在體外研究葉綠素的生物活性對乳酸鏈球菌（Lactic streptococci）的生長及代謝的影響，試圖探索作為非營養物質之一的葉綠素是否能促進乳酸菌屬中的乳酸鏈球菌種這類有益菌的生長，影響其產代謝物水平，進而起到促進乳酸鏈球菌調節腸道菌群，維持腸道菌群平衡的作用。此外，本試驗為后續葉綠素和乳酸鏈球菌二者在體內協同發揮降低體重，有益健康的作用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同一來源同一批次的新鮮菠菜（Spinacia oleracea L.）：中國農業大學家屬區種植購買；乳酸鏈球菌（Lactic streptococci）：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；色譜級甲醇、三氯甲烷、乙腈、正己烷：美國Thermo fisher公司；濃硫酸、95%乙醇等均為分析純試劑，試驗中所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設備

CR21GⅢ型高速冷凍離心機：日本日立公司；DHP-9082恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計：日本島津公司；JYDZ-31B九陽打漿機：九陽股份有限公司；Acquit UPLC液相色譜儀（UPLC）：美國Agilent公司；T6新世紀旋轉蒸發儀：北京普析通用儀器有限責公司。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素的制備

參照Rivera-Chávez等[17]的方法提取新鮮菠菜中的葉綠素。將洗凈晾干的菠菜葉去梗，放攪拌機中，并倒入適量乙醇，攪拌成漿。按照料液比1∶3（g/mL）的比例再加入95%乙醇（體積分數），混勻后4℃，8 000 g條件下離心6 min，所得上清液在36℃水浴條件下旋轉真空蒸發濃縮，靜置過夜后去除上清獲得葉綠素濃漿。葉綠素水平測定參照張雅婕[18]的方法并做修改，用移液槍吸取1 mL葉綠素濃縮液，梯度稀釋100倍后分別在645、663 nm處測吸光度值OD，以80%丙酮（體積分數）為對照。葉綠素水平計算公式如下：

式中：Ca代表葉綠素a濃度，mg/L；Cb代表葉綠素b 濃度，mg/L；C 代表葉綠素總濃度，mg/L；A645代表樣品在645 nm下的吸光值；A663代表樣品在663 nm下的吸光值。

本試驗中，得到葉綠素溶液平均濃度為7.8mg/mL。

1.3.2 菌種的活化和乳酸鏈球菌培養

參照Wolf等[19]方法，并稍作修改，進行菌種的活化。取1mL甘油貯存液菌種接入到19 mL營養肉湯培養基內，在37℃培養24 h，活化兩代后，第三代活化至對數中后期，混勻后取適量菌液3 000 r/min離心10 min棄去上清液，用0.9%NaCl溶液還原至相同體積后，稀釋10倍備用。

參照Prückler等[20]的方法并稍作修改。取出冷凍的1.5 mL乳酸鏈球菌EP管室溫融化后，接種到20 mL液體厭氧培養管中，同時加入1 mL葉綠素粗提液，以不加葉綠素粗提液為空白對照，置于37℃的水浴搖床中（70 r/min）培養24 h，得到乳酸鏈球菌發酵液。

1.3.3 乳酸鏈球菌生長曲線的測定

參照Di Cagno等[21]的試驗方法，每隔2 h用1 mL注射器吸取乳酸菌發酵液1 mL在紫外600 nm下測OD值，并記錄試驗數據，繪制乳酸菌生長曲線。

1.3.4 有機酸及短鏈脂肪酸測定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定有機酸、短鏈脂肪酸等乳酸菌代謝產物的變化趨勢[22-25]。具體試驗方法為：分別配制草酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、正戊酸等標準品的系列濃度梯度，用0.22 μm的水相濾膜進行過濾，濾液用高效液相色譜法測定，定量分析后繪制標準曲線，用于后續有機酸和短鏈脂肪酸含量的計算。HPLC條件為：用超純水作為流動相A，在13 mm水系濾膜下過濾后的0.005 mol/L H2SO4作為流動相B，等梯度洗脫，流速 0.5 mL/min，柱溫 65 ℃，進樣量 10 μL，檢測波長為210 nm。

1.4 數據統計分析

每個試驗重復至少3次，數據統計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Origin 8.1（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）制圖軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 葉綠素對乳酸鏈球菌生長曲線的影響

葉綠素對乳酸鏈球菌生長曲線的影響見圖1。

圖1 乳酸鏈球菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Lactic streptococci

如圖1所示，葉綠素的添加能顯著提高乳酸鏈球菌菌液的OD值（P＜0.05），且葉綠素對乳酸鏈球菌生長曲線趨勢無影響，與對照組一致。0～2 h內是乳酸鏈球菌的急速增長期，乳酸鏈球菌OD值由0.62上升至0.89，上升43%。因此我們推測0～2 h為乳酸鏈球菌可以充分利用并消耗葉綠素而促進自身生長的最有效時期。

2.2 葉綠素對乳酸鏈球菌代謝物水平的影響

2.2.1 葉綠素對乳酸鏈球菌產草酸的影響

葉綠素對乳酸鏈球菌產草酸的影響見圖2。

圖2 葉綠素對乳酸鏈球菌產有機酸——草酸水平的影響Fig.2 Effect of chlorophyll on the content of organic acid（oxalic acid）by Lactic streptococci

由圖2可知，和對照組相比，添加葉綠素后24 h內代謝物中草酸水平顯著降低（P＜0.05），其中6 h～10 h內降低最為顯著。Sasikumar等[26]研究發現乳酸菌可以降解草酸，降低人體腎臟草酸水平，減輕腎臟負擔，同時增加尿液中的草酸的排泄。Mogna等[27]通過對比乳酸桿菌和雙歧桿菌的降解草酸能力，得出了前者的草酸降解能力強于后者，有約68.5%的草酸銨鹽能被其降解。本研究發現，和單獨的乳酸鏈球菌相比，葉綠素的添加能顯著降低草酸水平（P＜0.05），可能存在兩方面原因，一是葉綠素促進乳酸鏈球菌的增殖，有效降解草酸。二是葉綠素可以提高乳酸鏈球菌降解草酸的能力，具體的原因還需要進一步研究。

2.2.2 葉綠素對乳酸鏈球菌產乳酸，檸檬酸水平的影響

乳酸鏈球菌進入腸道后，通過代謝產生乳酸和檸檬酸，可以有效的抑制有害細菌的增殖和生長，維持機內生態平衡和腸道的正常機能[12－13]。因此乳酸鏈球菌對腸道內菌群的組成和調節具有非常重要的作用，研究葉綠素對乳酸鏈球菌產生乳酸和檸檬酸水平的影響，有助于更好的了解其在腸道中的代謝情況。葉綠素對乳酸鏈球菌產乳酸，檸檬酸水平的影響如圖3所示。

圖3 葉綠素對乳酸鏈球菌產有機酸——乳酸、檸檬酸水平的影響Fig.3 Effect of chlorophyll on the content of organic acid（lactic acid and citric acid）by Lactic streptococci

由圖3可見，添加葉綠素后，和對照組相比，在24 h內乳酸，檸檬酸水平顯著提高（P＜0.05），其中檸檬酸含量提高達5%。檸檬酸、乳酸水平的升高，均能促進三羧酸循環和糖酵解過程[22]。檸檬酸可以直接參與三羧酸循環，而乳酸水平的升高可以逆反饋，抑制丙酮酸轉化成乳酸；丙酮酸作為三羧酸循環的起始底物，丙酮酸水平增加又進一步促進檸檬酸水平的升高[28]。因此檸檬酸和乳酸水平的升高能促進能量代謝，從而促進機體對營養物質的吸收。Coda等[23]研究發現乳糖在乳酸鏈球菌的作用下，可以產生乳酸，檸檬酸等，降低生境內氧化還原電位和pH值，起到抑制部分致病菌、有害菌和腐敗菌增長的作用。此外，乳酸鏈球菌能產生乳酸鏈球菌素，對大腸桿菌素和金黃色葡萄球菌素等具有一定的拮抗作用[14]。因此，將乳酸鏈球菌用于保健食品，可以增強機體對致病菌的抵抗力。本試驗中發現添加葉綠素顯著促進乳酸鏈球菌產乳酸、檸檬酸水平，說明葉綠素可以通過增加乳酸和檸檬酸水平對人體健康產生積極的作用。

2.2.3 葉綠素對乳酸鏈球菌產短鏈脂肪酸水平的影響

乳酸鏈球菌絕大多數代謝產物都對人體有益，尤其是短鏈脂肪酸，如乙酸與肥胖的相互作用，丙酸是糖酵解的底物，丁酸的抗癌作用[12]。添加葉綠素培養乳酸鏈球菌24 h后，檢測乳酸菌短鏈脂肪酸的含量，結果如圖4所示。

圖4 葉綠素對乳酸鏈球菌產短鏈脂肪酸水平的影響Fig.4 Effect of chlorophyll on the content of short chain fatty acids by Lactic streptococci

圖4為葉綠素對乳酸鏈球菌代謝短鏈脂肪酸的影響，其中主要檢測到乙酸、丙酸和正戊酸。如圖4（A）所示，和未添加葉綠素的對照組相比，添加葉綠素對乳酸鏈球菌產乙酸水平無顯著性影響（P＞0.05）；但圖4（B、C）中，添加葉綠素2 h后，和對照組相比，丙酸水平微量升高、正戊酸水平顯著升高（P＜0.05）。添加葉綠素促進乳酸鏈球菌代謝產物丙酸、正戊酸水平升高，與乳酸鏈球菌OD值的增大呈現正相關，可能葉綠素通過促進乳酸鏈球菌數量的增加，促進其代謝產物的增加[8]。Kageyama等[29]進行動物實驗研究表明，無菌小鼠腸道上皮細胞由于能量不足會發生自噬現象，影響上皮細胞的完整性，而添加丙酸后腸道細胞自噬現象消失，說明丙酸能給小腸上皮細胞提供能量，從而減少細胞凋亡。此外，丙酸還是糖酵解的底物，能有效促進糖酵解過程，促進能量代謝[15]。因此，添加葉綠素后增加乳酸鏈球菌產丙酸水平，有利于人體營養健康。Donohoe等[30]研究發現短鏈脂肪酸的種類和數量和人體健康具有一定的相關性。過敏性疾病患兒在早期與正常兒童腸道中的腸道菌群有明顯差異，所以短鏈脂肪酸的種類和數量也表現出明顯的差異，過敏性疾病患兒腸道中丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的水平均比正常兒童低。因此，建議多過敏性患者攝入葉綠素，促進體內短鏈脂肪酸的生成。

3 結論

本研究通過體外添加葉綠素培養乳酸鏈球菌發酵24 h，發現葉綠素的添加顯著促進乳酸鏈球菌增殖，且0～2 h為乳酸鏈球菌的有效增殖期。此外，葉綠素促進乳酸鏈球菌產代謝物水平增加，其中有機酸水平上，草酸水平顯著降低，乳酸、檸檬酸水平顯著升高；短鏈脂肪酸水平上，正戊酸水平顯著增加，丙酸水平輕微增加，乙酸水平則無顯著性差異。綜合以上結論本研究發現葉綠素影響了乳酸鏈球菌的生長及代謝，證明葉綠素具有一定的生物活性，可以和乳酸鏈球菌協同發揮促進健康的作用。