紅景天苷提取工藝優化及對FADS1基因表達的影響

羅毅皓，萬玉慧，孫萬成

（青海大學農牧學院，青海西寧810016）

隨著國民生活水平的日益提高，人們的飲食結構 發生了巨大改變，高脂類食物的攝入比例逐步增加，隨之而來的人體脂肪代謝問題引起了廣泛的關注。各種降脂類食品的研發及需求日益增長，更多能改善人體脂肪代謝速率的新產品應運而生。紅景天一直被認為是抗缺氧、抗疲勞以及抗衰老等作用的佳品[1]，王樹海通過研究紅景天苷對脂肪細胞糖代謝的作用機理及影響，結果發現紅景天苷可以增加脂肪細胞葡萄糖的攝取和利用[2]，王崢嶸通過研究紅景天提取物對高脂飲食大鼠肝臟PPAR－α、PPAR－γ的影響，對小鼠的血生化指標進行測定，研究表明紅景天提取物有效地降低了小鼠血液中的甘油三酯、高膽固醇、高游離脂肪酸含量，證明紅景天提取物可有效改善脂肪代謝[3]。然而鮮有關于紅景天苷在細胞層面對脂肪代謝影響的研究，本試驗則設計通過使用組織細胞培養，定量加入紅景天苷的方式，從分子水平探討紅景天苷作用細胞脂肪代謝后的結果，即通過測定與細胞脂肪代謝有關酶的基因（fatty acid desaturase 1，FADS1）表達量來進一步探討紅景天苷對細胞脂肪代謝的影響。

本試驗通過研究紅景天苷的提取溫度、時間、料液比等幾個因素對提取率的影響，在單因素試驗的基礎上，利用Box－Behnken中心組合試驗設計對紅景天苷的提取工藝進行優化，得出水提法提取紅景天苷最佳提取工藝條件，最終建立一個高效、節能、無毒、無污染、操作簡便、生產經濟的紅景天苷的提取方法[4]。隨后進行HepG2肝癌細胞培養，待細胞生長至對數生長期，即細胞密鋪于培養瓶底80%～90%左右時，通過添加不同濃度的紅景天苷至組織細胞中，繼續培養24 h后進行提取總RNA的提取，隨即在逆轉錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉錄產物為模板，利用實時定量熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測組織細胞中FADS1基因mRNA的表達水平，分析FADS1基因在不同濃度紅景天苷培養下的相對表達量差異，探究紅景天苷對細胞脂肪代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

紅景天樣品：青海可可西里食品有限公司，用KC－130小型粉碎機將其粉碎后，貯存于4℃冰箱內備用；紅景天苷標準品：北京世紀奧科生物技術有限公司；HepG2肝癌細胞：上海生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設備

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒（提取 RNA）、TaKaRa PrimeScriptRRT reagent Kit試劑盒（反轉錄）、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ：寶生物工程（大連）有限公司；DEME（高糖）培養基、雙抗、DPBS、胎牛血清FBS、胰蛋白酶細胞消化液：生工生物工程（上海）股份有限公司。

PCR儀（ABI 97000）：上海迭戈生物科技有限公司；熒光定量 PCR（CFX96 TouchTM）：BIO－RAD 公司；Leica熒光倒置顯微鏡（DMI4000B）：北京萬泰恒通國際科貿有限公司；CO2培養箱（IL161CT）：施都凱儀器設備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅景天苷提取與檢測

將干燥的紅景天根樣品置于粉碎機中粉碎，準確稱取1.000 0 g紅景天粉末置于錐形瓶中，以蒸餾水為溶媒，在時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、溫度 40、50、60、70、80℃等試驗條件下進行提取操作，隨后進行真空抽濾，收集濾液。將濾液在沸水中加熱2 min～3 min，隨后置于冰箱冷卻，經0.22 μm濾菌膜過濾，濾液全部轉移至100 mL容量瓶中定容[4]。吸取1 mL提取液于100 mL容量瓶中再次定容，并于紫外分光光度計下波長為275 nm進行吸光值A的檢測（m2=0.087 2A+0.129 2），紅景天苷的濃度在 20 μg/mL～120 μg/mL 與吸光度呈線性相關，按公式計算紅景天苷得率：

式中：E為紅景天苷得率，%；m為稱取樣品的質量，mg；m2為提取液中紅景天苷的濃度，mg/mL。

1.3.2 HepG2肝癌細胞培養

HepG2肝癌細胞培養方法參考文獻[5]。

1.3.3 HepG2肝癌細胞總RNA的提取、PCR及熒光定量PCR

HepG2肝癌細胞總RNA的提取、PCR及熒光定量PCR方法參考文獻[5]。

2 結果與分析

2.1 響應面法優化紅景天提取工藝

在已知單因素的試驗結果基礎上，設定A（提取溫度）、B（提取時間）、C（料液比），以 Z1=（A－50）/10，Z2=（B－1.5）/0.5，Z3=（C－20）/10 為自變量，紅景天苷得率為響應值（Y），利用響應面法進行三因素三水平Box－Benhnken中心組合試驗設計，試驗因素及其水平如表1。

表1 因素水平設計表Table 1 Table of factors and levels for design

響應面分析試驗共有17個試驗，中心試驗用來估計誤差。17組響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗分析Table 2 Analysis of response surface

響應面分析如圖1～3所示，圖1是提取溫度（A）和提取時間（B）對提取率影響，圖2是提取溫度（A）和料液比（C）對提取率影響，圖3是提取時間（B）和料液比（C）對提取率影響。

圖1 提取溫度（A）和提取時間（B）對提取率影響Fig.1 Temperature（A）and extraction time（B）influence on extraction rate

圖2 提取溫度（A）和料液比（C）對提取率影響Fig.2 Effect of temperature（A）and material liquid ratio（C）on extraction rate

圖3 提取時間（B）和料液比（C）對提取率影響Fig.3 Effect of time（B）and liquid ratio（C）on extraction rate

在一個因素已經確定的情況下，另外兩個因素的變化趨勢呈現出先增大后減小的變化，從響應面最高點及其對應的等值線內可以看出，在所選區域范圍內存在著極值，既是響應面上的最高點，也是等值線內最小橢圓內的點。圖1可以看出隨著A、B數值的減小，響應值Y大幅度減小，說明短時、低溫不利于紅景天苷的提取，圖3直觀表明料液比的加大及提取時間的加長，紅景天苷部分水解，會導致小幅度區間內紅景天苷的得率的降低[6-8]。

響應面方差分析見表3。

表3 響應面方差分析表Table 3 Response surface variance analysis

由此可知，一次項B是高度顯著的，二次項A2、B2、C2也是高度顯著的，所選因素對響應值的關系非簡單線性關系。經二次回歸擬合，得到回歸方程：Y=1.82+0.056×A+0.22×B+0.099×C+0.015×A×B-2.500×10-3×A×C+5.000×10-3×B×C-0.49×A2-0.26×B2-0.23×C2

從上表數據中可以得出，各因素對紅景天苷提取率的影響次序依次為：B>C>A，即提取時間>料液比>提取溫度。可信度分析見表4。

表4 可信度分析表Table Reliability analysis

由表4可知，該回歸模型也是高度顯著的。判定系數R2=0.982 6，可以表明紅景天苷提取率有98.26%來源于所選變量，使用上述回歸方程來模擬，三因素三水平的試驗是切實可行的。由Design-expert8.0.6處理以上數據，得到最佳提取溫度為50.64℃、提取時間 1.71 h、料液比 1 ∶22.22（g/mL），理論最佳提取率為1.89%。為了檢驗響應面法的可行性，試驗條件修正為紅景天苷提取溫度為50.6℃、提取時間1.7 h、料液比 1∶22.2（g/mL），進行紅景天苷提取的驗證試驗，3次平行試驗得到的平均提取率為1.85%，與理論值相差0.04%。因此，響應面法對紅景天苷提取條件的優化是可行的。

2.2 紅景苷對HepG2肝癌細胞FADS1基因表達影響

2.2.1 HepG2肝癌細胞FADS1基因擴增電泳

圖4為肝癌細胞提取的RNA，經反轉錄及PCR擴增后得到FADS1的DNA電泳跑膠圖。利用在編碼區兩側設計的FADS1基因通用引物擴增目的DNA，獲得約120 bp的DNA片段。

圖4 FADS1基因電泳圖Fig.4 FADS1 gene electrophoresis diagram

從圖4中可以看出反轉錄得到的確為實驗所需的FADS1目的基因，無引物二聚體及非特異性擴增產物的存在，且樣品擴增條件的退火溫度48.9℃適宜，可將反轉錄得到的cDNA用于后續實時熒光PCR試驗[9-12]。

2.2.2 紅景苷對HepG2肝癌細胞中FADS1基因表達影響

紅景苷對HepG2肝癌細胞中FADS1基因表達影響如圖5所示，隨著紅景天苷濃度增加，FADS1基因表達量增加。

脂肪酸去飽和酶1（FADS1）基因作為人體內n-3及n-6系列脂肪酸轉化的限速酶基因，其表達量決定細胞合成不飽和脂肪酸能力的高低。如圖5可知，紅景天苷可以有效提高FADS1基因表達量，誘導機體產生更多脂肪酸去飽和酶，從而調節與載體結合的飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸在酰基鏈上形成更多雙鍵，最終使脂肪酸不飽和程度提高，而起到降低血脂的作用[13-17]。

圖5 不同紅景天苷濃度組FADS1基因相對表達量Fig.5 Relative expression of FADS1 gene in the different concentration of rhododendrons

3 結論

1）紅景天苷響應面法優化提取工藝，提取最佳工藝為提取溫度 50.6℃、時間 1.7 h、液料比 1∶22.2（g/mL）。

2）各因素對紅景天苷提取率的影響次序依次為：提取時間>料液比>提取溫度。

3）紅景天苷提取過程中為防止紅景天苷水解，應避免長時間、高料液比處理。

4）紅景天苷可刺激與脂肪代謝有關的FADS1基因表達量的增加，促進脂肪酸去飽和酶的合成，影響人體脂肪代謝過程，使機體內飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸含量降低，多不飽和脂肪酸含量增加。