厚樸中蛋白質提取方法的優化

翁德會，楊文婷，湯雅萍，范承濤，劉翠，程勛

（1.武漢華夏理工學院生物與制藥學院，湖北武漢430223；2.武漢工商學院環境與生物工程學院，湖北武漢430065）

厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.Var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，俗稱“紫油厚樸”。味苦、辛、性溫，歸脾、胃、肺、以及大腸經，具有燥濕消痰，溫中下氣的功效，臨床主要用于濕滯傷中，腕痞吐瀉，腹脹便瀉，痰飲咳喘以及食積氣滯等[1]。其主要產地位于四川、浙江、廣西、湖北、湖南等地。在中成藥中，采用厚樸配方的多達200多種，不同產地厚樸其性狀和有效成分含量有一定區別。現今對不同產地厚樸的鑒定研究多集中在DNA提前和分析、不同化學成分如木脂素、揮發油等含量分析方面，對蛋白質提取分離及電泳指紋圖譜研究較少[2-3]。

蛋白質電泳指紋圖譜的構建前提是需從樣品中提取高質量高含量的蛋白質，故厚樸中的蛋白質提取是其蛋白質電泳指紋圖譜研究中重要的一環。本研究對厚樸中的蛋白質進行提取鑒定，取以靜置過夜、超聲清洗儀超聲提取、超聲破碎法3種不同的方法提取蛋白質[4-5]，通過考馬斯亮藍法測定其蛋白質含量，繼而得到提取蛋白質含量最高、效率最高的方法。再通過單因素試驗以及正交試驗得到厚樸蛋白質提取方法的最佳條件，為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行不同產地厚樸的鑒別鑒定提供研究基礎[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

厚樸：湖北省恩施中藥材生產規范示范基地，經湖北中醫藥大學鑒定教研室張林碧教授鑒定為木蘭科植物厚樸的干燥樹皮、根皮和枝皮。

牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250：廈門星隆達化學試劑有限公司；磷酸、磷酸氫二鉀（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

DG120型粉碎機：浙江省瑞安市飛達藥材器械廠；JY91-2D超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機：湘麓離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料的預處理

將不同產地的厚樸于粉碎機中粉碎，過60目篩，收集粉末，裝于不同的自封袋中，放置于4℃中冷藏。

1.3.2 牛血清白蛋白標準曲線的繪制

稱取一定量的牛血清白蛋白粉末，配制成200 μg/mL的牛血清蛋白溶液，用移液管分別取5 mL考馬斯亮藍G250染液于試管中，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制好的牛血清蛋白溶液，添加蒸餾水至溶液總體積6 mL。靜置5 min，在10 min內測量吸光度，以蛋白質濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制牛血清白蛋白的標準曲線[8]。

1.3.3 3種方法提取厚樸蛋白質的比較

分別以冷浸法、超聲清洗儀提取法、冰浴超聲破碎法提取厚樸的蛋白質。取厚樸樣品3份，每份1 g，分別加入緩沖液16 mL提取樣品中蛋白質，冷浸法提取12 h，超聲清洗儀100 W提取30 min，在超聲破碎儀功率150 W、超聲間隔時間8 s的條件下處理樣品20 min。每種方法做3次平行試驗，取浸提液0.1 mL采用考馬斯亮藍法測量吸光度，取平均值，以確定厚樸的蛋白質提取的合適方法[9-11]。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 超聲破碎時間對厚樸提取液蛋白質濃度的影響

控制超聲功率150 W，超聲破碎間隔8 s，取不同的超聲時間 10、20、30、40、50 min 提取蛋白質，經考馬斯亮藍法測得其浸提液中蛋白質濃度。

1.3.4.2 超聲功率對厚樸提取液蛋白質濃度的影響

控制超聲時間30 min，超聲破碎間隔8 s，取不同的超聲功率 100、150、200、250、300 W 提取蛋白質，經考馬斯亮藍法測得其浸提液中蛋白質濃度。

1.3.4.3 超聲破碎間隔時間對厚樸提取液蛋白質濃度的影響

控制超聲時間30 min，超聲功率150 W，取不同的超聲間隔時間12、10、8、6、4 s提取蛋白質，經考馬斯亮藍法測得其浸提液中蛋白質濃度。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選用超聲破碎時間（30、40、50 min），超聲功率（200、250、300 W），超聲破碎間隔時間（4、6、8 s）3個因素，每個因素設 3個水平，采用三因素三水平的正交試驗設計L9（33），見表1。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結果分析與討論

2.1 牛血清蛋白標準曲線的繪制

根據1.3.2中方法測定不同濃度下的牛血清蛋白溶液的吸光度，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 牛血清白蛋白的標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

如圖1所示，標準曲線方程為A=0.004 9C+0.015 2，R2=0.997 2，表明在 0～200 μg/mL 濃度范圍內，線性關系良好。

2.2 3種方法提取厚樸蛋白質的比較

3種不同蛋白質提取方法的蛋白質提取濃度見表2。

表2 3種不同蛋白質提取方法的比較Table 2 Comparison of three different protein extraction methods

由表2可知，3種不同蛋白質提取方式中，以超聲破碎法提取厚樸蛋白質效果最佳，提取的蛋白質濃度在3種提取蛋白質的方法中最高，綜合考慮，確定超聲破碎法進一步進行提取條件的優化。

2.3 單因素試驗

2.3.1 超聲破碎時間對厚樸提取液蛋白質濃度的影響

在超聲功率150 W，超聲破碎間隔8 s的條件下，考察不同超聲破碎時間對蛋白提取率的影響結果見圖2。

圖2 超聲破碎時間對蛋白質提取濃度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the protein extraction concentration

由圖2可知，蛋白質溶解于提取液是一個緩慢的過程，超聲破碎時間從10 min～40 min，蛋白質提取率升高，當超聲破碎時間為30 min，厚樸蛋白的提取率達到最大為880.11 μg/mL，再隨著超聲時間延長，蛋白質提取率呈現降低趨勢，分析原因，可能是由于一定時間后，蛋白的溶出達到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進一步延長浸提時間，可能是厚樸纖維素、淀粉等與蛋白質發生結合，使蛋白質難以溶出，從而使提取率降低，且超聲破碎時間過長，樣品易受微生物污染，影響蛋白產品的質量。因此選擇超聲破碎時間30 min為最佳條件。

2.3.2 超聲功率對厚樸提取液蛋白質濃度的影響

在超聲時間30 min，超聲破碎間隔8 s條件下，超聲功率對厚樸蛋白提取率的影響結果見圖3。

圖3 超聲破碎功率對蛋白質提取濃度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the protein extraction concentration

由圖3可知，當超聲功率為250 W時，提取到的厚樸蛋白最高，為840.41 μg/mL。當超聲功率小于250 W時，厚樸蛋白濃度隨功率增加而增加，說明功率越高，蛋白質的提取率越高，蛋白質濃度也越高；而當超聲功率大于250 W時，厚樸蛋白質的濃度開始降低，說明功率過大雖然會增加細胞破碎率，但由于功率增大的同時對活性物質的破壞力也有所增大，同時考慮到節約能源，因此超聲功率選擇250 W較為適宜。

2.3.3 超聲間隔時間對厚樸提取液蛋白質濃度的影響

超聲間隔時間是超聲破碎過程中的重要因素之一，其直接影響細胞破碎率，而且不同時間間隔還會引起超聲破碎過程中熱效應和空化效應的改變，影響蛋白質的活性，控制超聲時間30 min，超聲功率250 W條件下，超聲間隔時間分別以4、6、8、10、12 s進行超聲細胞破碎，見圖4。

圖4 超聲間隔時間對蛋白質提取濃度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic interval time on the protein extraction concentration

由圖4可知，在一定范圍內，隨著超聲破碎間隔時間的增大，厚樸蛋白質濃度逐步減小，在超聲破碎間隔時間為4 s時，厚樸蛋白質濃度最高，為862.86 μg/mL，之后蛋白質濃度呈下降趨勢。在超聲破碎間隔時間為4、6、8 s時，蛋白質濃度下降不明顯，而在8 s到10 s蛋白質濃度影響較大，可能是因為超聲破碎時間間隔過長會影響其破壁效果，使蛋白質無法充分溶出。考慮到超聲破碎時間間隔過短會影響到儀器的使用壽命，因此，選擇超聲破碎間隔時間6 s進行超聲破碎。

2.4 正交試驗

2.4.1 正交試驗結果分析

正交試驗方案及結果見表3。

表3 正交試驗方案及結果Table 3 Orthogonal test scheme and results

由表3可以看出，超聲破碎提取厚樸蛋白質正交試驗結果中，極差的高低順序為：破碎時間>間隔時間>超聲功率，即超聲破碎時間對提取厚樸蛋白質的影響最大，其次是超聲破碎間隔時間，影響最小的因素是超聲破碎功率。由表3還可見，從厚樸提取蛋白質的最佳超聲破碎工藝條件為，即超聲功率250 W，超聲破碎時間30 min，超聲間隔時間6 s。即取1 g厚樸蛋白質粉末，加入4 mL稀釋4倍的濃縮膠緩沖液，在250 W的超聲功率下，取超聲間隔間隔6 s，超聲破碎30 min。

2.4.2 驗證性試驗

根據正交試驗得出的最佳條件提取3次，取3份厚樸粉末，進行3次平行試驗，測得蛋白質濃度分別為930.87、934.21、933.15 μg/mL，RSD 值為 0.18%，說明該條件下所得的蛋白質濃度基本穩定，條件可行。

3 結論

通過比較3種不同方式提取蛋白質的效率，確定超聲破碎法提取為最佳。試驗過程中發現用超聲清洗儀超聲破碎時其溫度會隨著超聲時間的增加而增加，這可能會使蛋白質因溫度的升高而變性失活，因此在冰浴條件下進行超聲破碎能避免這一問題。蛋白質的提取是蛋白質指紋圖譜構建中重要的一環，供試樣品的蛋白質含量不能達到要求的話在電泳之后就無法得到清晰完整的條帶[12-13]。在前期相關研究中，因提取樣品的蛋白質含量過低，無法跑出達到清晰的電泳圖譜，故在本研究中對超聲破碎提取蛋白質的方法進行了優化，選擇超聲破碎時間、超聲時間間隔以及超聲破碎功率等因素，進行單因素試驗和正交試驗，繼而得出最佳的蛋白質提取方式。結果表明，在超聲破碎時間30 min，超聲間隔時間6 s，超聲破碎功率250 W時蛋白質提取濃度達到最大為930 μg/mL，達到了蛋白質電泳的靈敏度要求，為后續進行厚樸的蛋白質指紋圖譜研究提供了研究基礎。