響應面法優化冰蘋果梨發酵酒工藝

孟祥敏，南海龍，丁鑫，郝建宇，薛海，文連奎

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

蘋果梨為薔薇科（Rosaceae）梨屬果樹的果實[1]，為白梨（Pyrus bretschneideri Rehd）系統中優質品種之一，產于我國吉林省延邊朝鮮族自治州，果肉白色，脆嫩多汁，酸甜適口[2]。鮮梨果實中富含氨基酸、黃酮、碳水化合物、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素 B1、維生素 B2、維生素PP、維生素C等多種營養物質。現代研究表明蘋果梨還具有潤肺健脾、軟化血管、和胃止嘔止瀉、消痰止咳等保鍵功能[3-5]。

蘋果梨主要用于鮮食，因貯藏方式單一，貯藏量僅占產量3%[2]。目前有關蘋果梨深加工的報道主要有蘋果梨酒、蘋果梨果凍、蘋果梨果醋、蘋果梨飲料、蘋果梨脆片[6-10]等。蘋果梨在加工過程中容易發生褐變，影響其風味、色澤。因此，當地人們將其冷凍為冰梨后食用，不僅風味獨特，而且易貯藏。本研究以冰蘋果梨為原料，研究其發酵酒工藝，為蘋果梨深加工產品開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料與輔料

蘋果梨：延邊地區；白砂糖（食品級）：吉林省鴻海有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母（食品級）：湖北安琪酵母有限公司；檸檬酸（食品級）：長春健鷹食品添加劑公司。

1.1.2 藥品與試劑

氫氧化鈉、鹽酸、酚酞：天津科密歐化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀、葡萄糖標準品：北京紅星化工廠；硫酸銅、次甲基藍等（分析純）：北京化工廠。

1.1.3 儀器與設備

電子分析天平（AUY220）：Shimadzu Philippines公司；生化培養箱（SPX-250B-Z）：上海市博訊事業有限公司；電熱恒溫水浴鍋（KW-1000DC）：金壇市科儀器有限公司；手持糖度計（WYT-4）：上海精密儀器儀表有限公司；酒精計：河間市儀器廠；pH計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 冰蘋果梨發酵酒工藝流程

蘋果梨→冷凍→解凍→壓榨→加SO2抑菌→糖度調整→干酵母活化→發酵→過濾→陳釀→澄清→原酒

1.2.2 操作要點

蘋果梨：果實中等大小，完全成熟且無蟲害潰爛。

冷凍：采取室外陰涼處分散放置自然冷凍，從11月中旬至次年2月中旬，期間平均最高氣溫為-5℃，最低氣溫為-18℃，平均溫差為13℃。

解凍：將蘋果梨切塊，在20℃下解凍30 min。

壓榨：半解凍狀態下壓榨，丟掉殘渣和冰渣，留取含糖量較高的冰蘋果梨汁。

加SO2抑菌：加入50 mg/L的SO2。

調糖度：蘋果梨自身含糖量在9 g/L～10 g/L，半解凍壓榨后糖度為17 g/L～18 g/L，最終糖調整可溶性固形物為22 g/L。

干酵母活化：將酵母與2%的糖水以1∶10（質量體積比）的比例混勻，在38℃的溫度下活化30 min，菌液活菌數約為8.2×107cfu/mL。

接種：按試驗設計接種發酵。

發酵：將活化好的酵母菌加到調整好的蘋果梨汁中，留少量空氣提供酵母生長，按試驗設計的溫度和時間進行發酵，前期適度攪拌，后期保持無氧發酵。

過濾：將發酵殘渣、沉淀物分離除去。

陳釀：在10℃～15℃下陳釀2個月。

澄清：12℃～15℃下放置6個月。

1.2.3 試驗設計

以酒精度為指標，研究發酵溫度、時間、pH值和酵母添加量對冰蘋果梨發酵酒發酵效果的影響，進行單因素及響應面優化試驗。

1.2.3.1 冰蘋果梨酒發酵單因素試驗

發酵時間：pH值調至4.0，接入0.5 g/L的活性酵母，在 18 ℃下分別發酵 16、18、20、22、24 d，確定最佳發酵時間。

發酵溫度：pH值調至4.0，接入0.5 g/L的活性酵母，分別在 14、16、18、20、22 ℃的溫度下進行發酵 22 d。

酵母添加量：pH值調至4.0，分別接入0.40、0.45、0.50、0.55、0.6g/L的活性酵母，在18℃下恒溫發酵22 d。

pH值：接入0.5 g/L的活性酵母，將pH值分別調至3.6、3.8、4.0、4.2、4.4，在 18℃下恒溫發酵 22 d。每組試驗重復3次，取平均值。1.2.3.2 響應面優化試驗

根據單因素的試驗結果，利用響應面法選取發酵的pH值A（℃）、酵母菌接入量B（g/L）、發酵的溫度C為3個因素，以酒精度為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計。

1.2.4 冰蘋果梨發酵酒的理化指標

酒精度的測定：酒精計法；總糖、殘糖的測定：斐林試劑直接滴定法；總酸、揮發酸的測定：酸堿中和滴定法；干浸出物的測定：密度瓶法[11]；pH值的測定：pH計法；可溶性固形物的測定：手持糖度計法；總二氧化硫、游離二氧化硫的測定：直接碘量法。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 發酵時間對冰蘋果梨發酵酒的影響

發酵時間對冰蘋果梨發酵酒的影響見圖1。

由圖1可知，酒精度隨發酵時間的延長而增加到某一終點，由于發酵溫度較低導致發酵速度緩慢，在發酵第22天時酒精度達到最高且保持穩定。因此發酵時間確定為22 d。

圖1 發酵時間對冰蘋果梨發酵酒的影響Fig.1 Effects of fermentation time amount on ice-pingguoli pears pall fermented wine

2.1.2 發酵pH值對冰蘋果梨發酵酒的影響

發酵液的pH值直接影響著冰蘋果梨發酵酒的品質，當pH值過低時會抑制酵母菌的活性，且影響發酵速度，而當pH值過高時，導致代謝酶系的活力降低[12]，pH值對冰蘋果梨發酵酒的影響見圖2。

圖2 pH值對冰蘋果梨發酵酒的影響Fig.2 Effects of pH on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由圖2可知，當pH值為3.8時，酵母代謝最旺盛，酒精度值達到最高，并隨著pH值增大而降低，故選取pH值3.6、3.8、4.0繼續進行下一步試驗。

2.1.3 酵母添加量對冰蘋果梨發酵酒的影響

酒精是酵母菌利用糖發酵而產生的，酵母菌的添加量直接影響酒精度的變化，活性酵母菌的添加量對冰蘋果梨發酵酒的影響見圖3。

圖3 活性酵母菌的添加量對冰蘋果梨發酵酒的影響Fig.3 Effects of yeast addition amount on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由圖3可知，當酵母添加量為0.5 g/L時剛好能夠代謝完全，酒精度達到最高，當添加量超過0.5 g/L時，酵母自身消耗的糖分及其他營養物質增多，代謝的副產物也隨之增多，會使其活性過早衰退。而當接種量過低時，糖分得不到充分轉化，影響酒體發酵，故選取接種量0.45、0.5、0.55 g/L進行響應面試驗。

2.1.4 發酵溫度對冰蘋果梨發酵酒的影響

發酵溫度對冰蘋果梨發酵酒的影響也很大，考慮到冰蘋果梨香氣本身較淡，所以發酵溫度采用低溫，發酵溫度對冰蘋果梨發酵酒的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對冰蘋果梨發酵酒的影響Fig.4 Effects of temperature on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由圖4可知，發酵溫度低導致發酵速度緩慢[13]，但是當溫度在20℃時，酒精度達到最高12.2%vol，溫度在18℃時，酒精度為11.9℃，為更多的保存原汁果香，故選取溫度值18、20、22℃進行下一步試驗。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

根據單因素試驗結果，選取發酵的pH值A（℃）、酵母菌接入量B（g/L）、發酵的溫度C為3個因素，以酒精度為響應值通過Design Expert 8.0.6進行三因素三水平響應面試驗，對數據進行處理分析，確定最佳發酵工藝。響應面試驗因素水平表見表1，響應面優化試驗設計及試驗數據見表2，回歸模型方差分析見表3[14-16]。

表1 響應面試驗因素和編碼水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 響應面優化試驗設計及試驗數據Table 2 Experimental design and results of response surface

續表2 響應面優化試驗設計及試驗數據Continue table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

利用Design Expert 8.0程序軟件對表2中的試驗結果進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到酒精度對冰蘋果梨發酵 pH（A）、酵母添加量（B）、溫度（C）的二次多項回歸方程：

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗結果如表3可知，回歸項中P＜0.000 1，說明所選模型差異極顯著。失擬項P=0.332 9＞0.05，即失擬項差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合冰蘋果梨發酵酒pH值、酵母添加量、溫度對酒精度的影響，該模型能夠代替試驗結果進行分析。模型的相關系數R2=0.981 3，校正決定系數R2Adj（0.961 9＞0.80）且變異系數（CV）為1.31%，說明該模型只有3.81%的變異不能由該模型解釋。說明模型擬合優度較好，可用來對酒精度的變化進行解釋并對其進行預測。當P＜0.000 1時，說明對應的所對應的試驗條件對酒精度的影響是極顯著的；P＜0.05時，則對應試驗條件為顯著。由表3可得回歸方程系數的顯著性，酵母添加量（B）、pH值的二次項A、酵母添加量的二次項B對冰蘋果梨發酵酒的酒精度具有極顯著影響；溫度（C）、pH（A）和酵母添加量（B）的交互項 AB、酵母添加量（B）和溫度（C）的交互項BC、溫度的二次項C對冰蘋果梨發酵酒的酒精度有顯著影響。

2.2.2 冰蘋果梨發酵酒酒精度的響應面分析

利用Design Expert軟件，得到相應的二次回歸方程的等高線及其響應面圖。響應面的曲面圖代表著兩個試驗的交互作用，通過坡度的大小即可判斷因素對響應值的影響程度。如圖5～圖7所示。根據模型所做的響應曲面及其相應的等高線圖可評估各因素對冰蘋果梨發酵酒酒精度的交互作用關系，其中酵母添加量對響應值酒精度的影響最大，溫度次之，最后是pH值。

圖5 pH值和酵母添加量交互作用對酒精度的影響Fig.5 pH and yeast addition amount interactions on alcohol content

圖6 pH值和溫度交互作用對酒精度的影響Fig.6 pH and temperature interactions on alcohol content

圖7 酵母添加量和溫度交互作用對酒精的影響Fig.7 Yeast addition amount and temperature interactions on alcohol content

由圖5可知，當溫度為18℃時，pH值在3.6～4.0、酵母添加量在0.45 g/L～0.55 g/L時，酒精度保持先升高后降低的趨勢，酵母添加量對酒精度作用顯著，發酵pH值對酒精度影響較小，pH值與酵母添加量交互作用顯著，當pH值在3.8～3.9，酵母添加量在0.5 g/L～0.53 g/L時酶系活力增強，酵母菌生長最旺盛，發酵效果最好，酒精度達到最高值。

由圖6可知，當酵母添加量為0.5 g/L時，隨著pH值的增加和溫度的提升，酒精度也逐漸增加，發酵溫度對酒精度作用顯著，pH值在3.8～3.9、溫度在20℃～21℃時，發酵效果最佳，酒精度達到最高值，而隨著pH值的升高，酒精度下降。

由圖7可知，當pH為3.8時，隨著酵母添加量的增加和溫度的提升，酒精度也逐漸增加，酵母添加量對酒精度的影響較大，此時糖分得到充分的轉化，酵母添加量在0.50 g/L～0.53 g/L時酒精度達到最高，溫度對酒精度影響也很大，在20℃～21℃時，發酵效果最佳，酒精度達到最高值。

最優工藝條件的預測及驗證運用Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行優化預測，即對回歸方程取一階偏導數等于0，得到冰蘋果梨發酵酒的最佳發酵工藝為：溫度20.25℃，酵母添加量0.52 g/L，pH值3.79，在此條件下冰蘋果梨發酵酒的酒精度為12.385 9%vol。根據實際試驗可操作性，將冰蘋果梨發酵酒加工工藝參數改為：溫度為20℃，酵母添加量為0.5 g/L，pH值為3.8。在此條件下對模型的預測參數進行3次平行驗證試驗，得到冰蘋果梨發酵酒酒精度為12.4%vol，與模型預測值較接近，表明采用響應面分析法優化得到的冰蘋果梨發酵酒發酵工藝參數可靠。

2.2.3 冰蘋果梨發酵酒的理化指標

經對發酵后的冰蘋果梨酒的理化指標分析，其酒精度 12.4%vol；總糖（以葡萄糖計）＜7 g/L；總酸（以檸檬酸計）3 g/L；揮發酸（以檸檬酸計）1 g/L；總二氧化硫＜250 mg/L；游離=氧化硫＜50 mg/L；干浸出物20.1 g/L。

2.2.4 冰蘋果梨發酵酒的感官指標

冰蘋果酒體呈淺紅棕色，澄清、無懸浮物，有蘋果梨獨特的清爽香氣和酒香，入口醇厚，微酸爽口。

3 結論

通過單因素試驗和中心組合設計試驗，采用響應面分析法優化冰蘋果梨發酵酒的發酵工藝條件，建立冰蘋果梨酒發酵工藝的二次多項數學模型。該模型極顯著，擬合情況好，可用來預測設定條件范圍內及其周圍的冰蘋果梨發酵酒發酵工藝參數，有一定實用價值。各因素對冰蘋果梨發酵酒發酵工藝的影響次序為酵母添加量＞發酵溫度＞pH值，優化后工藝條件參數為溫度為20℃，酵母添加量為0.5 g/L，pH值為3.8，發酵時間為22 d，在此條件下酒精度為12.4%vol，發酵所得的冰蘋果梨發酵酒清香可口，具有獨特的冰蘋果梨風味。