CrisprCas9系統敲除SDC1表達對骨髓瘤U266細胞增殖的影響

劉琳琳，莊銀蘋，王 永，徐 凱*

（徐州醫科大學醫學影像學院，江蘇 徐州 221004）

基金項目：徐州市科技項目（KC16SY149，KC16SY154）

通訊作者：徐凱，博士，教授，碩士生導師，E-mail：xkpaper@163.com

多發性骨髓瘤是一種極其惡性的血液系統疾病，顯著特點是漿細胞的克隆性增殖[1]。近年來，很多新的治療因子被批準用于治療難治復發性骨髓瘤患者，如硼替佐米，來那度胺，沙利度胺等[2-3]。然而，由于其嚴重的化療耐受作用，多發性骨髓瘤仍然是難以治愈的。因此，闡明骨髓瘤的發病機制，尋求新的靶向治療藥物是當前骨髓瘤研究的熱點問題。蛋白多糖Syndecan 1（SDC1）是骨髓瘤發生的重要標志分子之一，位于細胞表面，又稱之為CD138。目前，多種研究證實SDC1與結直腸癌和神經膠質瘤的發生發展密切相關[4-5]。本研究擬利用CrisprCas9慢病毒系統沉默SDC1基因的表達，探索其對骨髓瘤細胞增殖的影響，為尋找骨髓瘤治療新靶點奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1640培養基（Sigma公司），胎牛血清（Gibco公司），Trizol（Takara公司），SDC1,β-actin一抗和二抗購買于Proteintech公司，CD138流式抗體購買于BD公司，RPMI-8226,U266和IM9細胞購買于美國菌種保存中心。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫印跡（western blot）

用RIPA強裂解液提取目的細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量（凱基生物）。每次取10 μl總蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳（80 V 40 min，120 V 60 min），并將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉至PVDF膜（100 V 120 min）。5%脫脂奶粉封閉1 h。按照1:1000比例稀釋SDC1，1:5000稀釋β-actin，4℃孵育過夜，按照1:2000稀釋兔二抗和鼠二抗，室溫孵育1 h，隨后用ECL顯色底物顯影。

1.2.2 實時熒光定量PCR（Q-PCR）

TRIzol法提取U266細胞總RNA，取1.5 μg RNA進行反轉錄。反應條件：25℃，10 min；37℃，90 min；85℃，5 min。反轉錄產物于-20℃保存。定量PCR引物序列如下：SDC1正向引物：CGTGGGGCTCATCTTTGCT，反向引物：TGGCTTGTTTCGGCTCCTC。β-actin為內參。反應體系：SYBR GreenⅠmix10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物（2μM）各3 μl，RNase- free水補足至20 μl。反應條件：50℃2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。

1.2.3 流式細胞術

正常收取細胞，計數每個樣品細胞數在1×106個。用100微升FACS buffer重懸樣品細胞，冰浴10 min，加CD138-BV421抗體2微升，輕輕婚姻，冰上孵育30 min，期間避光放置。然后加上1 ml FACS buffer 1500rpm離心5 min，洗滌2次，隨后用500微升FACS buffer重懸細胞，上機檢測。

1.2.4 CCK8法測細胞活力

將對照細胞和沉默SDC1基因表達的目的細胞密度調整為1×105個/ml，每孔接種100 μl細胞懸液，每組設置3個復孔，經不同時間點處理（24 h，36 h，48 h，72 h），加入CCK8 5μl避光處理3 h，隨后利用酶標儀測定450nm波長的吸光度值，進行3次獨立重復實驗，計算活力變化情況。

1.2.5 統計學分析

利用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析，組間比較使用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，具有統計學意義。

2 結 果

2.1 SDC1在多種骨髓瘤細胞中的表達情況

我們利用Q-PCR技術分析了SDC1基因在RPMI-8226,U266和IM9細胞中的表達情況，結果分析SDC1在RPMI-8226表達較低，在U266和IM9細胞中表達較高（圖1）。隨后，我們用U266細胞沉默SDC1基因，進行后續實驗。

圖1 SDC1基因在骨髓瘤細胞中的表達情況*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 SDC1在U266細胞中沉默效率的驗證

我們利用CrisprCas9慢病毒干擾系統沉默SDC1基因的表達，通過Q-PCR實驗證實SDC1敲除效率在70%以上（圖2A）。進一步蛋白免疫印跡實驗證實，CrisprCas9慢病毒干擾系統有效沉默SDC1蛋白的表達（圖2B）。

圖2 SDC1基因沉默效率的驗證**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 流式細胞術分析CD138標志分子的變化情況

沉默SDC1基因表達以后，我們進一步利用流式細胞術檢測了U266穩定沉默SDC1細胞株的SDC1陽性細胞率，結果顯示沉默SDC1后CD138陽性細胞顯著降低（圖3），為后續研究奠定堅實基礎。

圖3 流式分析CD138陽性細胞分子*P＜0.05

2.4 沉默SDC1后對細胞增殖的影響

我們利用已建立穩定沉默SDC1基因的U266細胞系,通過CCK8法檢測了不同時間點U266 control組及ko SDC1組的細胞活力情況，結果發現沉默SDC1后明顯抑制U266細胞的活力（圖4）。

圖4 CCK8檢測沉默SDC1后對細胞活力的影響

3 討 論

Syndecan (SDC)是一類進化上保守的I型跨膜糖蛋白，可以結合多種配合和受體，如FGFs，VEGFs，TGF-β，PDGFs，integrin以及VEGFR等。而SDC1是目前研究最廣泛的成員之一，其在腫瘤細胞中的差異表達與腫瘤發生和臨床預后密切相關[6-7]。Xu等人發現膠質瘤中SDC1的表達與惡性進程和不良預后呈正相關，暗示SDC1在膠質瘤發生過程中可能扮演重要角色[8]。最近有研究報道稱，在結腸炎誘導的結腸癌的小鼠模型中，干擾SDC1可誘導腫瘤的生長[4]。也有研究發現SDC1可能會調控粒層細胞的分化以及卵泡發育[9]。而SDC1在骨髓瘤進程中扮演什么角色呢。

SDC1（CD138）在惡性漿細胞中高水平表達，在疾病進程中發揮重要作用[10-12]。抑制SDC1表達促進TRAIL誘導的骨髓瘤細胞凋亡[13]。CD138是惡性漿細胞的重要標志分子，常用于骨髓瘤細胞的分離純化。最近有研究分析了正常氧和低氧脅迫條件下CD138分子的表達變化，分析低氧脅迫可以降低CD138的表達，與疾病進展密切相關[14]。本研究首先利用Q-PCR檢測了多種骨髓瘤細胞中SDC1基因的表達情況，采用CrisprCas9慢病毒敲除技術[15]。建立穩定敲除SDC1表達的U266骨髓瘤細胞系。利用蛋白免疫印跡實驗，Q-PCR及流式細胞術等手段檢測SDC1敲除效率。通過CCK8法分析分析敲除SDC1表達抑制骨髓瘤細胞的活力。

由于SDC1調控的靶基因較多，而SDC1也是骨髓瘤患者臨床檢測的重要標志分子之一，對其參與骨髓瘤進程的具體機制并不十分明確，SDC1基因是如何影響骨髓瘤細胞的增殖，還需要更加深入的研究。本研究建立的CrisprCas9技術沉默SDC1的載體可以有效的沉默靶基因的表達，為進一步探究SDC1基因的功能奠定基礎，SDC1有望成為臨床治療難治復發性骨髓瘤患者的重要潛在靶點。