HPLC-MS/MS法測定2017-2018年淮安地區小龍蝦中硝基呋喃類代謝物殘留量

吳 旭，卜媛 媛

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300）

硝基呋喃類抗生素因具有抑菌性和殺菌性，曾廣泛用于水產養殖中傳染病的預防和治療[1]。主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因四種，而其對應的代謝產物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、l-氨基-2-內酰脲(AHD)都能與蛋白質緊密結合，形成穩定的殘留物，殘留時間達數周以上，甚至在蒸煮、微波加熱等情況下仍然無法降解。研究表明硝基呋喃類抗生素及其代謝產物對人體有潛在毒理性危害。歐盟將其列為A類禁用藥物[2],且在2005年時又禁止在人類和動物中使用；美國在2002年將其禁用于食源性動物；日本也規定牛肉、豬肉、禽肉、蝦肉都不得檢出抗生素；我國農業部在2002年頒布禁令禁止將硝基呋喃類藥物用在食源性動物身上。

江蘇省淮安市盱眙縣有著”中國龍蝦之都”的美譽,自2001年至今,已舉辦了18界龍蝦節。盱眙境內年產龍蝦10萬噸，年交易量15萬噸，交易額突破60億元。如今，盱眙80萬人中有10萬余人在龍蝦產業鏈上淘金，龍蝦已經成為盱眙縣的支柱產業。

但是一些養殖場高密度飼養、養殖污水不處理等，導致疫病的爆發，為了預防和治療病害，養殖戶違法使用了硝基呋喃類抗生素。本研究通過對淮安地區小龍蝦產品中，硝基呋喃類代謝產物的殘留量檢測，為該地區小龍蝦中違禁藥物使用情況進行調查，以促進小龍蝦產業的健康發展，保障人民的食品安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

AOZ、SEM、AMOZ、AHD，農業部環境保護科研檢測；D5-AMOZ，13C15N-SEM，13C3-AHD，D4-AOZ，北京曼哈格生物科技有限公司；2-硝基苯甲醛，純度99%以上，Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二甲亞砜等均為色譜純，鹽酸、K2HP04、NaOH等均為分析純；水為Milli-Q制備的超純水；pH精密試紙(4.5-10.0)。

API4000+超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（沃特世公司），C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，沃特世公司），XS205DU電子天平（METTLER TOLEDO公司）。

1.2 色譜條件

流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃，進樣體積2 μL。流動相：A相0.1%甲酸水溶液；B乙腈,采用梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3 質譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI+）；檢測方式：多選擇反應監測；CAD：4V；CUR：30 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；霧化電壓：5500 V；離子傳輸溫度：500 ℃。的質譜條件見表2。

表2 質譜條件

2 樣 品

2.1 樣品來源

淮安地區各農貿市場和水產養殖廠抽樣的小龍蝦共計83批,覆蓋淮安所有地區，采樣時間為小龍蝦生產季節（5～8月份），每批抽樣小龍蝦產品隨機采集5份樣品，每份樣品1000 g。

2.2 取樣方式

采樣組織為蝦頭、蝦殼和蝦肉、清洗整蝦和未清洗整蝦。因小龍蝦個體較小，每次用20只小龍蝦組織，混合制樣。

2.3 樣品制備

提取：稱取均勻試樣（2g）于50 mL棕色具塞離心管中，加入10mL甲醇-水混合液（2+1），均質1 min，再用5 mL甲醇-水洗滌均質器刀頭，二者合并4000 r/min離心5 min，吸取上清液棄掉。向每個樣品管中加入混合內標溶液，使最終測定濃度均為2.0 ng/mL。

水解和衍生：向上述每個離心管中加入10 mL0.2 mol/L鹽酸溶液均質1min，用10mL 0.2mol/L鹽酸溶液洗滌均質器刀頭，二者合并后加入0.3 mL0.0 5mol/L2-硝基苯甲醛溶液，用液體混勻器混勻，置恒溫水浴振蕩器中37℃避光振蕩16 h。

凈化:取出離心管冷卻至室溫，加人5mL0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，用1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.4，4000 r/min離心10min，上清液倒入下接Oasis HLB柱的貯液器中，使樣液以＜2 mL/min的流速通過Oasis HLB柱，待樣液全部通過Oasis HLB柱后用10 mL水洗滌Oasis HLB柱，棄去流出液。用真空泵在65 kPa負壓下抽干Oasis HLB柱15 min。用5 mL乙酸乙酯洗脫被測物于25 mL棕色離心管中，用氮吹儀在40℃水浴中吹干，用樣品定容溶液溶解并定容至1.0 mL，過0.2 μm濾膜用液相色譜-串聯質譜測定。同時做空白試驗。

3 結果與討論

3.1 結果比較

2017年淮安地區小龍蝦產品40批，2018年43批，共計83批，結果見表3。在這兩年中呋喃西林仍然存在違規用藥情況，2017年檢出率62%，2018年檢出率63%，而呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥因均未有檢出。

表3 2017～2018年淮安地區小龍蝦產品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測結果

本方法中AOZ、AMOZ、SEM、AHD的檢出限均為0.50μg/kg，四種代謝物加標回收率70%～106%，相對標準偏差RSD≤10%，符合國內外相關規定要求。

3.2 SEM問題

在檢測中，很多樣品都檢測出了陽性的SEM，空白時SEM的檢出率在10%以下，濃度在0.21μg/kg左右。

將小龍蝦的蝦頭、蝦殼和蝦肉分別檢驗，發現在蝦殼中SEM的含量最高，蝦肉中SEM含量只是整蝦的1/10，見圖1。可見SEM檢測結果和取樣的組織部位有很大關系。

圖1 小龍蝦各部分中SEM含量

將同一批蝦清洗和未清洗分別檢驗，發現未清洗的SEM含量是清洗過后的1.1倍，可見在養殖的水體[3]和池塘的底泥[4]中可能也含有呋喃西林，見表2。

表2 清洗與為清洗的小龍蝦全蝦中SEM的含量

4 結 論

本文采用HPLC-MS/MS法測定2017-2018年淮安地區小龍蝦中硝基呋喃類代謝物的殘留量。結果發現除了SEM外，其他代謝物都沒有檢出，說明四種硝基呋喃類藥物中，之前在水產養殖中常用的呋喃唑酮已得到有效控制，但是呋喃西林的使用有增無減。而樣品的取樣部位對SEM的結果影響很大，處理樣品時務必混合均勻，同步做好空白實驗進行比較。同時也要注意SEM的假陽性問題，對于SEM是不是由小龍蝦蝦殼中自身產生，還有待進一步研究，所以SEM的定性也是檢測的一大難點。簡單的從SEM的測定結果上就判斷使用了呋喃西林違禁藥品，也有失公允。