鯉科魚類HIF-1的研究進展

韓青青，王 華，李 鑫，曹詣斌

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004）

在魚類的生存及生長發育中，水中的溶解氧起著很重要的作用。與空氣中氧含量相比，水中溶解氧含量只有同體積空氣氧含量的3%，所以，與陸生生物相比，水生生物對氧氣的利用率更為重要[1]。由于水體本身溶氧量的特點及外界環境的影響，使得水體低氧成為自然現象。魚類為適應水環境中溶解氧濃度的波動，已形成了不同的應對策略[2]。而作為低氧相關基因調控的核心轉錄因子的低氧誘導因子HIF-1在魚類低氧應答中起著重要的作用。

鯉科魚類是鯉形目中分布最廣、種類也最多的一群，為魚類中最大的一科，約有200多屬2 000多種，都是淡水魚類，分布很廣。我國鯉科魚類中的主要經濟魚類有“四大家魚”（青魚Mylopharyngodon piceus、草魚 Ctenopharyngodon idellus、鰱 Hypophthalmichthys molitrix、 鳙 Aristichthys nobilis）、鯉Cyprinus carpio、鯽 Carassius auratus、鳊 Megalobrama terminalis、團頭魴Parabramis pekinensis等，是池塘養魚的主要對象。其中，作為重要的模式生物，人們廣泛采用斑馬魚來研究低氧對胚胎發育、免疫應答和代謝調節等的影響。同時，鯽魚和金魚是低氧耐受能力最強的淡水魚類之一，是迄今唯一一種能在室內不依賴氣泵而長期生存的魚類，擁有一系列獨特的低氧適應生理機制，例如，可通過乙醇脫氫酶（Acetaldehyde Dehydrogenase，ADH）將無氧呼吸產生的乳酸轉化為乙醇，然后從鰓部排出，避免了長期無氧呼吸可能導致的酸中毒[3]；金魚鰓部組織也具有常氧和低氧狀態下進行結構可塑性轉化的能力[4-5]。鑒于HIF-1在動物低氧應答中所發揮的重要作用，有必要對目前鯉科魚類HIF-1的研究背景與進展進行闡述。

1 低氧誘導因子（HIF-1）的發現、調節及其在鯉科魚類中的克隆

在肝癌細胞株Hep3B細胞低氧處理后的核提取物中，WANG等[6]發現了一種能與紅細胞生成素基因增強子特異性地結合的蛋白質，由于它廣泛存在于缺氧細胞內，命名為低氧誘導因子（HIFs）。HIFs能特異性地與其靶基因調控區的低氧應答元件結合，從而激活靶基因的轉錄，促進機體和細胞對低氧環境的適應。

低氧誘導因子1（HIF-1）是HIF-1α和HIF-1β 2種亞基組成的具有轉錄活性的異二聚體，HIF-1α的分子量為120kD，HIF-1β的分子量為91～94 ku。其中，α亞基受到氧濃度的調控，是低氧誘導因子的調節亞基。而β亞基則持續性表達，不受氧濃度的影響，2種亞基的N端均含有bHLH/PAS同源區，對于二聚化和與靶基因表達調控區的結合是必需的[7]。在HIF-1α亞基中部存在一個氧依賴性降解結構域（Oxygen-Dependent Degradation Domain，ODDD）；C-末端包括2個反式激活結構域（TAD），即TAD-N和TAD-C[8]。目前，針對HIFs的研究主要在HIF-α上，哺乳動物體內一共發現3種HIF-α亞基，HIF-1α，HIF-2α以及HIF-3α[9]（圖1），HIF-1α和HIF-2α具有48%的氨基酸序列一致性，并且可以識別相同的DNA結合區域，但是又具有各自獨特的生物學效應。研究表明，HIF-2α參與長期慢性缺氧，而HIF-1α與急性缺氧有關[10]，HIF-3α只在高血管組織如眼角膜中表達。

在常氧的情況下，HIF-α亞基的半衰期很短，細胞不斷合成和降解蛋白質。氧濃度對α亞基降解的調控是通過ODDD域中2個脯酰胺殘基（Pro402和Pro564）的羥基化實現的。羥基化反應由脯酰胺羥化酶（prolyl hydroxylase，PHDs）催化，活性取決于氧、2-酮戊二酸和輔因子Fe2+的水平。脯氨酸的羥基化使HIF-α亞基與腫瘤抑制基因蛋白（von Hippel-Lindau tumor suppressor，pVHL）相互作用，并通過泛素蛋白酶體通路被降解[11]。在氧濃度下降時，脯氨酰基羥基化受到抑制，穩定的HIF-1α向細胞核內轉移并與HIF-1β形成HIF-1二聚體，然后與目的基因表達調控區域的低氧應答元件結合，調節靶基因的表達[12-13]。Pro402和Pro564在魚類HIF-1α中保守，推測這種調節機制也同樣存在于鯉科魚類中。

關于HIF的研究目前在哺乳動物中比較深入，同時在魚類包括在一些鯉科魚類中也展開了初步研究，如魚類HIF-1α序列特征最早在草魚[14]、斑馬魚（Barchydanio rerio var）[15]、青海裸鯉（Gymnocypris przewalskii）[16]、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[17]等魚中相繼報道。而HIF-2α基因在斑馬魚、草魚等魚中也有一定的研究[18]。

2 低氧對鯉科魚類HIF-1及其靶基因的影響

斑馬魚作為鯉科魚類的模式動物，人們對低氧誘導斑馬魚胚胎HIF-1的表達，HIF-1及其靶基因啟動子的鑒定等展開了研究。常氧環境中，在斑馬魚胚胎的不同發育階段均可檢測到HIF-1α蛋白，但各階段之間沒有顯著差異，而HIF-2α和HIF-3α在孵化后期水平比前期顯著上升；低氧處理使HIF-1α蛋白水平明顯上升，而HIF-2α和HIF-3α蛋白不受影響，表明HIF-2α和HIF-3α在早期發育中更為重要，而HIF-1主要參與低氧應答[19]。在斑馬魚胚胎發育中進行低氧或完全缺氧處理會激活HIF-1途徑，并在幼魚期表現出較高的低氧耐受能力，同時導致在魚群中雄魚占較高比例[20]。WANG等[21]研究發現，TET1蛋白作為TET（teneleventranslocation）家族的甲基胞嘧啶雙加氧酶的一員，對于斑馬魚和小鼠的低氧耐受不可或缺。Tet1缺陷型斑馬魚和小鼠與野生型相比，對低氧更為敏感。Tet1采用不同的方式促進HIF-α的穩定性并增強其轉錄激活活性，Tet1競爭性地抑制PHD2與HIF-2α的結合，降低HIF-2α的羥化水平；相反，Tet1并不影響HIF-1α的羥化，而是通過對HIF-1α C-末端賴氨酸的修飾提高其穩定性。

低氧還通過HIF-1影響斑馬魚對銅污染，以及巨噬細胞與內皮細胞的相互作用。在斑馬魚早期胚胎發育中，常氧下采用HIF羥化酶的抑制劑DMOG處理，HIF的穩定性顯著提高并降低了銅毒性[22]。巨噬細胞在發育和病理性血管生成中與內皮細胞相互作用，但其分子機制并不清楚。斑馬魚中HIF-1α突變導致血管生成和血管修復缺陷，使得巨噬細胞從主動脈-性腺-中腎（AGM）的動員被削弱[23]。轉錄組分析低氧處理的斑馬魚VHL突變胚胎，檢測到許多在人類低氧細胞模型中被激活的關鍵低氧應答基因，但同時抑制許多脂類代謝相關基因的表達[24]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理顯著增高斑馬魚HIF-1α的mRNA水平，并在處理8 h后達到峰值，推測LPS與低氧協同調節斑馬魚HIF-1α的轉錄水平[25]。

除了斑馬魚以外，在其他鯉科魚類如鯽魚、草魚、武昌魚和裸鯉等中，人們也對HIF-1及其靶基因在低氧環境中表達展開了研究。在鯽魚鰓組織中，HIF-1α蛋白在常氧環境也保持一定水平，而低氧導致HIF-1α更加穩定，但HIF-1靶基因iNOS mRNA水平沒有顯著差異[26]。Northern blot分析顯示，低氧誘導草魚腎臟HIF-1α mRNA水平的上升，并在眼睛、鰓、心臟、腎和肝組織中誘導HIF-4α mRNA水平的上升。Western blot分析表明，內源HIF-1α和HIF-4α蛋白水平均同樣受低氧誘導，推測草魚HIF-1α和HIF-4α在轉錄水平和翻譯水平受到不同方式的調節[27]。低氧誘導草魚肝臟和腎臟CITED1，CITED3a和CITED3b mRNA水平顯著上升，熒光素酶報告基因表明，HIF-1激活這3個基因的啟動子。CHIP分析顯示，常氧與低氧中肝臟與腎臟組織這3個基因啟動子與HIF-1的結合存在顯著差異。同時CITED1，CITED3a和CITED3b對HIF-1的轉錄激活活性具有負反饋抑制作用[28-29]。在武昌魚中，低氧處理使HIF-2α mRNA水平在肝臟和腎臟中分別上升了910%和320%，同時HIF-1α mRNA水平在相應組織中沒有明顯變化[17]。在青海湖裸鯉不同組織中，HIF-1α的靶基因Glut-1 mRNA水平與低氧處理時間具有相關性[16]。在普通鯉魚中，肌紅蛋白基因啟動子中存在HRE元件，這一特征解釋了低氧在非肌肉組織中誘導mb-1基因表達的現象。但在mb-2基因中，有一段10 bp序列插入到上游激活因子（upstreamstimulatoryfactor，USF）結合位點中。由于USF是HIF的一個輔助轉錄因子，從而可能導致mb-2對低氧不產生應答反應[30]。

3 溫度和重金屬對鯉科魚類HIF-1的影響

3.1 溫度

在鯽魚中，為了研究HIF-1的功能是否參與了與溫度適應相關的基因表達變化以及在低溫適應中的作用，RISSANEN 等[31]在 8，18，26 ℃研究了常氧和低氧（0.7 mg/L）條件下HIF-1 DNA結合活性和HIF-1α表達，結果表明，HIF-1活性隨著溫度的下降而增加，甚至比對氧濃度的降低更加敏感，顯示體溫和缺氧之間的相互作用調節鯽魚HIF-1的功能。

3.2 重金屬

ZIZZA等[32]將鯽魚暴露在亞致死濃度（1.45mg/L）和較低濃度（0.3 mg/L）的CuCl2中，對HSP90及HIF-1α的轉錄水平進行了檢測，結果表明，銅誘導HSP90的下調和HIF-1α的上調，這可能與魚類中金屬誘導損傷的修復有關。KWONG等[33]研究證明，在斑馬魚中，低氧會抑制斑馬魚對Ca2+的吸收，是通過HIF-1介導的上皮鈣離子通道表達的影響。FITZGERALD等[22]發現低氧和常氧條件下銅對于斑馬魚的影響存在顯著差異。在常氧條件下，暴露于0.07 mg/L Cu導致斑馬魚死亡率為75.5%，而在低氧條件下，沒有發生銅誘導的致死效應。在20 μmol/LDMOG存在下，在常氧下0.07mg/LCu處理的死亡率為0，這說明HIF通路的激活使銅金屬的毒性顯著降低。KHATIB等[34]在斑馬魚魚鰭再生期間將魚暴露于CoCl2后，觀察到再生魚鰭非常脆弱并且容易裂縫，導致魚在水中活動時容易發生魚鰭部分或全部損失，這是由于正常的魚鰭再生需要軟骨內骨化，也就是軟骨停止增殖，而氯化鈷處理導致HIF水平上升，而HIF促進軟骨繼續增殖，使得軟骨不會內骨化，導致再生鰭脆弱。