數(shù)字PCR技術(shù)及其應(yīng)用

楊茜

【摘要】數(shù)字PCR是繼第一代、第二代PCR技術(shù)之后，迅速發(fā)展起來的一種核酸絕對定量技術(shù)。在大量反應(yīng)室中獨立擴增單分子核酸，采集產(chǎn)生的熒光信號，通過計算得到檢測結(jié)果。在病原微生物檢測、產(chǎn)前診斷以及癌基因診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文對數(shù)字PCR的原理、分類以及應(yīng)用方面進行了綜述。

【關(guān)鍵詞】數(shù)字PCR；醫(yī)學(xué)檢驗；分類；應(yīng)用

【中圖分類號】Q503 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2018.06.17..02

1985年K.Mullis發(fā)明的聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR），可以在體外模擬體內(nèi)核酸的合成過程，大大縮短了實驗周期、降低科研成本，是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項革命性壯舉。但傳統(tǒng)的PCR技術(shù)也有弊端，僅能進行半定量測定，在分析產(chǎn)物時需要進行開蓋操作，容易產(chǎn)生假陽性[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，能夠?qū)崟r定量檢測核酸的實時熒光定量PCR技術(shù)（quantitative PCR，qPCR）、數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）也相繼出現(xiàn)，一舉攻克傳統(tǒng)PCR的技術(shù)難題。而數(shù)字PCR憑借其高通量、高準確度的特點，有著極為廣泛的應(yīng)用前景[2]。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR技術(shù)包括兩部分，PCR擴增以及熒光信號分析。它的原理是將含有DNA模板的反應(yīng)體系稀釋分離成單分子，分配到大量的反應(yīng)單元中進行PCR擴增反應(yīng)，采集每個反應(yīng)單元的熒光信號，有熒光信號記為1，無熒光信號記為0。通過陽性微滴的比例或泊松分布公式計算樣本的原始濃度或拷貝數(shù)，最終獲得結(jié)果[3]。

2 數(shù)字PCR技術(shù)分類

數(shù)字PCR的靈敏度取決于檢測器的靈敏度、PCR擴增效率以及反應(yīng)單元的數(shù)目。根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式，將PCR技術(shù)分為三類系統(tǒng)：

2.1 微反應(yīng)室數(shù)字

PCR是在不銹鋼芯上刻蝕了數(shù)以千計的微反應(yīng)室，同時也將每個反應(yīng)單元的體積從微升級降至納升級，提高了樣品同量，但需要借助高通量的自動點樣儀，提高了儀器成本和操作復(fù)雜性[4]。

2.2 微流控芯片數(shù)字

PCR是建立在微流體技術(shù)、納米制造技術(shù)和微電子技術(shù)等發(fā)展之上的，它的出現(xiàn)為我們提供了一個實現(xiàn)低成本、小體積和高通量PCR分析的理想平臺[5]。

2.3 液滴數(shù)字

PCR系統(tǒng)是在擴增之前進行微滴化處理，以極低的濃度包裹于油水兩項形成的數(shù)萬個納升至皮升級液滴中，每個液滴都是一個獨立的反應(yīng)體系，擴增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，破乳后收集進行測序[6]。該技術(shù)的優(yōu)勢在于，能夠把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中，避免了引物與引物之間、不同產(chǎn)物之間的相互影響[7]。同時可以在不同的反應(yīng)室中進行同時擴增，實現(xiàn)了高通量測定。

3 數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用

3.1 病原微生物的檢測

目前醫(yī)院主要通過qPCR對血液、腦脊液等臨床樣本進行病原微生物的檢測，但qPCR仍存在較多缺點：不同實驗室標準品或者對照品之間存在誤差，導(dǎo)致實驗室內(nèi)或者不同實驗室之間qPCR的檢測結(jié)果有差異，需建立統(tǒng)一標準曲線[2] ；Yan[8]等采取感染H7N9的患者十個不同治療時期的樣本，分別進行qPCR及dPCR檢測，發(fā)現(xiàn)對于qPCR陰性的樣本，dPCR仍可以檢測出病毒的存在，說明dPCR的靈敏度遠高于qPCR。數(shù)字PCR不僅可以對病原體定性，而且還能對病原體DNA或RNA序列進行絕對定量，從而對疾病進行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預(yù)后觀察，目前數(shù)字PCR技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于HBV、HIV、甲型流感病毒等臨床領(lǐng)域[9]。

3.2 腫瘤診斷

許多腫瘤早期就出現(xiàn)癌基因的突變和表達異常，dPCR技術(shù)不僅能有效地檢測到癌基因的突變，而且可以準確定量其表達。如肺癌表皮生長因子受體、神經(jīng)膠質(zhì)瘤異檸檬酸脫氫酶及葡萄膜黑色素瘤突變的檢測[9]。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控，其與癌癥也密切相關(guān)[10]。田輝等人[11]建立了一種基于連接反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR檢測單細胞中miRNA，這與研究與miRNA有關(guān)的疾病有著重要的意義。

3.3 產(chǎn)前診斷

產(chǎn)前診斷可以在出生前對胎兒的發(fā)育狀態(tài)、患有的疾病等方面進行檢測。傳統(tǒng)的侵入方法如羊水穿刺和絨毛取樣，存在讓孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險[10]。1997年，LO[12]發(fā)現(xiàn)了存在于孕婦外周血的胎兒游離的cffDN A，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的思路。2017年，LO[13]利用數(shù)字PCR進行了cffDNA的異常分析，用于21三體綜合征的診斷，上述方法可檢測血液中25%的胎兒基因。Barrett[14]利用cffDNA進行了鐮狀紅細胞貧血的檢測。

dPCR作為一項新的技術(shù)，還存在許多問題需要解決和探討。相信隨著科技的進步與技術(shù)的革新，該技術(shù)定將廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。

參考文獻

[1] 趙煥英，包金風(fēng).實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進展[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2007（04）：492-497.

[2] 胡思宏，鮑登克，萬紹貴.數(shù)字PCR及其在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子診斷中的應(yīng)用[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2017，33（09）：861-866.

[3] 李春勇.數(shù)字PCR技術(shù)原理及應(yīng)用[J].生物技術(shù)世界，2014（11）：10-13.

[4] 林彩琴，姚 波.數(shù)字PCR技術(shù)進展[J].化學(xué)進展，2012，24（12）：2415-2423.

[5] 王 琦，范 穎.微滴式數(shù)字PCR技術(shù)進展[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版），2016，8（11）：15-19.

[6] 趙治國，崔 強，趙林立，王海艷，李剛，劉來俊，敖威華，馬彩霞.微滴數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用進展[J].中國生物工程雜志，2017，37（06）：93-96.

[7] 胡瑞麗，杜亞楠，趙 凱，施 偉，趙 笑，任方方，吳洋洋，唐雪明.微滴PCR技術(shù)的研究進展[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2016，27（14）：290-291.

[8] Yan Y，Jia X J，Wang H H，et al.Dynamic quantification of avian influenza H7N9（A） virus in a human infection during clinical treatment using droplet digital PCR[J].Journal of Virological Methods，2016，234：22-27.

[9] 楊德平，劉維薇.數(shù)字PCR技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用進展[J].臨床檢驗雜志，2016，34（10）：785-787.

[10] 馮兆民，舒躍龍.數(shù)字PCR技術(shù)及其應(yīng)用進展[J].病毒學(xué)報，2017，33（01）：103-107.

[11] 田 輝.基于連接反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR檢測單細胞中MicroRNA[D].陜西師范大學(xué)，2016.

[12] Lo，Dennis Y M，Corbetta，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet，1997，350（9076）：485-487.

[13] Lo Y M，Lun F M，Chan K C，et al.Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（32）：13116-13121.

[14] Barrett，Angela N，McDonnell，Thomas C R，Chan，K C Allen，Chitty，Lyn S.Digital PCR Analysis of Maternal Plasma for Noninvasive Detection of Sickle Cell Anemia[J].Clinical Chemistry，2012，58（6）.

本文編輯：王雨辰