TLRs通過STAT3促進乳腺癌細胞PD—L1表達的實驗研究

白云龍 王建杰

【摘要】目的 探討TLRs信號通路對乳腺癌細胞株PD-L1表達的調控作用。方法 用western blotting檢測乳腺癌MCF7細胞株與MDA-MB-231細胞株PD-L1蛋白的表達；選用tolls樣受體特異性激動劑LPS和阻斷劑TAK-242刺激乳腺癌細胞后檢測兩株乳腺癌細胞PD-L1、STAT3轉錄因子、STAT3的表達情況；構建靶向STAT3的siRNA和STAT3質粒轉染MCF-7和MDA-MB-231細胞后檢測PD-L1的表達情況。結果 用LPS激活TLRs后，MCF-7和MDA-MB-231細胞株的PD-L1表達分別升高1.5倍和2.4倍；用TAK-242抑制TLR后，MCF-7細胞中PD-L1表達下調1.7倍，而MDA-MB-231的PD-L1的表達量無顯著變化；用LPS激活TLRs后，MCF-7和MDA-MB-231細胞株的STAT-3表達分別升高1.5倍和2.4倍；用TAK-242抑制TLR后，MCF-7細胞中STAT-3表達下調1.7倍，而MDA-MB-231的STAT-3的表達量無顯著變化。結論 本研究證明TLRs通過STAT3信號通路對PD-L1進行調控，為聯合干預TLRS和PD-L1抑制腫瘤免疫逃避，提高乳腺癌治愈率據。

【關鍵詞】乳腺癌；免疫逃避；TLRs；PD-L1；STAT3

【中圖分類號】R737.9 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095.6681.2018.06.17..02

免疫系統對腫瘤細胞具有監視和殺傷作用，而腫瘤則可通過多種免疫逃逸機制抵抗或逃避免疫系統對腫瘤細胞的殺傷和清除，三陰性乳腺癌和孕激素/雌激素受體陽性乳腺癌是否通過調控程序性死亡受體1配體（PD-L1）介導腫瘤細胞免疫逃避不清楚[1-2]，本研究將通過探索TLRs信號通路對乳腺癌細胞株PD-L1表達的調控機制，研究PD-L1和TLRs的調控關系，提高乳腺癌治愈率提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

乳腺癌細胞株MCF-7與MDA-MB-231細胞株購自諾辰生物公司；胎牛血清購自澳大利亞clark公司；L15和RPMI-1640培養基購自gibco公司；TAK-242 TLR4抑制劑購自APEXBIO公司；LPS、TLR4樣受體激活劑購自碧云天公司；抗PD-L1，STAT3兔源多克隆抗體購自成都正能生物技術公司；抗PD-L1鼠源單克隆抗體購自sigama公司；STAT3 siRNA干擾質粒由上海吉凱基因公司合成。

1.2 Western Blotting

細胞長滿培養瓶壁，預冷PBS沖洗，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解，離心，取上清，加入buffer，電泳；半干式轉膜，脫脂乳封閉，孵育過夜，二抗孵育，上機檢測。

1.3 細胞轉染

將兩株細胞分別接種于六孔板中，分為無任何處理組、STAT3過表達組、siRNA-STAT3組、無義siRNA組、空載體質粒組，脂質體3000轉染，48小時后制作檢測樣品，上機檢測。

1.4 統計學處理

Western blotting均重復三次，隨后的各組實驗結果取平均值，計算各組數據的標準差、標準誤。計量資料兩組比較用配對樣本t檢驗、兩樣本t檢驗和多樣本的LSD-t檢驗，P<0.05表示有統計學意義。

2 結 果

2.1 TLRs促進乳腺癌細胞PD-L1表達

MDA-MB-231細胞PD-L1的表達量高于MCF-71.9倍（P<0.01），用LPS激活TLRs時，MCF-7細胞膜上PD-L1表達量上調1.5倍（P<0.01），MDA-MB-231細胞膜上PD-L1表達量上調2.4倍（P<0.01）；用TAK-242抑制TLRs時，MCF-7細胞膜上PD-L1表達水平則下調1.7倍（P<0.05），MDA-MB-231細胞無顯著變化。

2.2 STAT3是TLRs的下游轉錄因子

MDA-MB-231中STAT3的表達量高于MCF-72.2倍（P<0.01）；用LPS處理MCF-7細胞中STAT3表達水平3.1倍（P<0.001），提高MDA-MB-231細胞中STAT3表達水平1.9倍（P<0.01）；而TAK-242處理則下調了MCF-7細胞中STAT3表達水平1.6倍（P<0.01），MDA-MB-231細胞變化不顯著。

2.3 TLRs通過STAT3信號通路促進乳腺癌細胞PD-L1表達

在MCF-7和MDA-MB-231細胞中采用STAT3 siRNA敲減STAT3表達及用STAT3質粒升高STAT3表達；結果發現敲減STAT3可減少MCF-7細胞STAT3表達4.4倍（P<0.01），STAT3質粒升高則1.9倍（P<0.05）；敲減STAT3減少MDA-MB-231細胞STAT3表達2.8倍（P<0.001），敲減STAT3可分別減少MCF-7和MDA-MB-231細胞膜上PD-L1表達水平2.2倍和4.2倍（P<0.001）；反之高表達STAT3則分別提高5.2倍和3.8倍（P<0.001）。

3 討 論

免疫系統對腫瘤細胞具有監視和殺傷作用，而腫瘤則可通過多種免疫逃逸機制抵抗或逃避免疫系統對腫瘤細胞的殺傷和清除[3-4]。從本實驗結果來看，用LPS刺激后PD-L1的表達均上調，PD-L1的表達增加與降低是隨著STAT3的表達變化而變化的，證實STAT3是PD-L1的轉錄因子；TLRs信號通路可以通過STAT3上調PD-L1的表達來介導腫瘤免疫逃逸，本研究結果證明三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的PD-L1蛋白的表達量要高于孕激素/雌激素受體陽性乳腺癌細胞株MCF-7細胞株，證明PD-L1與TLRs信號通路的密切關系。本研究首次在乳腺癌中發現了TLRs通過STAT3信號通路對PD-L1的表達調控作用，為聯合干預TLRS和PD-L1抑制腫瘤免疫逃避，提高乳腺癌治療效果提供了科學依據。

參考文獻

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本文編輯：吳 衛