四環素抗納米細菌治療對泌尿系結石患者HK－2細胞損傷及結晶滯留的影響＊

申茂磊，王勤章，鄭麗英，錢 成，李 朋，錢 彪

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病之一［1－3］，由多種因素共同作用所致［4］，納米細菌（nanobacteria，NB）感染被認為是導致結石形成的主要原因之一［5］，其在腎結石患者的血液、尿液和結石中的陽性檢出率均在 90%以上［6－8］。有研究者通過檢測過氧化氫酶等損傷指標發現NB可以造成與其共同培養的HK－2細胞損傷，又通過觀察HK－2細胞與COM晶體的黏附情況發現被NB損傷細胞的晶體黏附性明顯增加［9］。然而由于NB的自我礦化特性，以至于眾多的抗生素都對其無效，但是四環素能沉積在納米細菌鈣化的外殼上并穿透外殼發揮抗菌作用［10］，是為數不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一。有研究者通過口服四環素片治療NB所致的Ⅲ型前列腺炎，發現83.3%的患者癥狀得到改善，表明四環素可能通過抗NB治療慢性前列腺炎［11］。但是四環素能否通過抗NB治療影響HK－2損傷及結晶滯留，從而達到預防以及治療NB所致腎結石的目的，不得而知。該研究首先用臨床確診腎結石且未應用藥物或手術治療患者的尿液培養NB，然后通過對NB、四環素等與HK－2細胞共培養，應用電鏡和共聚焦顯微鏡觀察HK－2細胞的損傷以及晶體滯留情況，探討四環素抗NB治療對HK－2損傷及結晶滯留的影響，以期為泌尿系結石的預防和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 HK－2細胞（購自武漢大學保藏中心），DMEM培養基，1640培養基，胎牛血清，HEPES緩沖液，四環素，細胞孵育箱，透射電子顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.2 實驗方法 收集臨床確診腎結石且未應用藥物或手術治療患者的尿液，具體培養鑒定方法參照褚浩等［12］文章。將HK－2細胞隨機分為3組，分別為NB組、四環素組和空白對照組，NB組、四環素組將人腎小管HK－2上皮細胞分別與NB、四環素和NB混合物共培養6 h、12 h和24 h，空白對照組只加入培養基培養6 h、12 h和24 h。

1.2.1 透射電子顯微鏡觀察 分別于6 h、12 h、24 h提取各組細胞制成細胞懸液，將提取好的懸液離心后轉移至EP管內，PBS浸泡10 min后棄掉上清；用預冷的3%戊二醛固定2 h，PBS緩沖液洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS緩沖液洗2次，同樣洗3 min/次；梯度乙醇脫水，經比例為1∶1的Epon812和環氧丙烷浸透，包埋后在80℃恒溫條件下聚合過夜，最后進行超薄切片、染色，于40透射電子顯微鏡下觀察細胞形態與超微結構變化。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實驗 將HK－2細胞接種于鋪有清潔蓋玻片的24孔板內，共同培養6 h、12 h、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液 （每孔內 COM 濃度200 mg/L），輕搖 5～10 s，COM晶體平鋪于底部，使HK－2細胞與COM晶體充分接觸。靜置3 min，將蓋玻片上方液體吸凈，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，經多聚甲醛固定、PBS洗后，再加入5 mg/L的phalloidin－FITC50 μl，室溫避光條件下孵育 20 min；PBS緩沖液洗2次后，利用甘油封片。在488 nm和633 nm激發光下逐一觀察各組玻片并進行圖像采集。

2 結果

2.1 透射電子顯微鏡觀察結果 12 h空白組HK－2細胞膜結構完整正常（圖A），膜外微絨毛數量豐富，排列規則，雙層核膜結構正常，核周隙正常，線粒體形態正常，線粒體脊排列規則有序，未見腫脹或萎縮 （圖B），NB組 HK－2細胞膜局部區域結構破損（圖C），微絨毛結構稍紊亂，局部絨毛消失，細胞核畸形，細胞核外形不規則，呈雙核或兩分葉，部分線粒體結構輕度腫脹（圖D），四環素組HK－2細胞膜結構完整（圖E），微絨毛結構稍紊亂，局部絨毛消失，部分線粒體結構輕度腫脹（圖F）；24 h空白組HK－2細胞各種結構如前所述（圖ab），NB組HK－2細胞膜結構破損，胞核裸露在外（圖c），微絨毛基本消失，線粒體數量較少，結構腫脹（圖d），四環素組HK－2細胞膜結構完整（圖e），微絨毛結構稍紊亂，局部絨毛消失，部分線粒體結構腫脹不明顯（圖f）。

圖1 12 h、24 h各組HK-2細胞透射電子顯微鏡觀察結果

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察結果 如圖2所示，培養6 h時，NB組可觀察到少量晶體黏附，并且隨著培養時間延長，細胞晶體黏附量進一步增加（圖B、E、H）；在 6 h、12 h 和 24 h 三個時間點，四環素干擾組中雖然有晶體黏附，但晶體黏附量均顯著少于NB組（圖C、F、I）；而空白組中三個時間點均未觀察到晶體黏附（圖 A、D、G）。

圖2 6 h、12 h、24 h各組激光共聚焦顯微鏡觀察結果圖片

3 討論

以往眾多研究表明，泌尿系結石的形成可能與雌激素、骨橋蛋白等有密切聯系［13，14］，但其發病機制仍不明確。近年來，多篇文獻報道NB在腎結石形成過程中具有關鍵性的作用［15］。NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，與體內多種病理性鈣化過程密切相關［16］。 Garcia 等［17］通過經皮腎臟注射NB建立大鼠腎結石模型，解剖發現腎小管廣泛鈣化，提出NB是形成結石的主要原因。賈宏偉等［18］通過大鼠尾靜脈注射NB，8 W后大鼠遠曲小管和近曲小管管腔出現不規則結晶體。

四環素可以穿透NB的鈣質外殼從而發揮抗菌作用。有文獻報道，四環素在治療NB相關的慢性前列腺炎［19］、間質性膀胱炎［20］等方面均取得了不錯的效果。胡衛國等［6］通過尾靜脈注射NB建立大鼠腎結石模型，發現四環素灌胃可以減少大鼠24 h尿LDH以及腎小管結晶數，推測四環素可能有抑制腎結石形成的作用。

該實驗通過HK－2細胞分別與各組作用物共培養，通過電鏡及共聚焦顯微鏡觀察發現NB可以引起HK－2細胞的損傷并導致結晶滯留，隨著共培養時間延長，細胞損傷程度和晶體黏附量進一步增加。這與既往研究結果一致，Xin等［9］從腎結石患者血液中提取NB，并與人腎小管上皮細胞HK－2共培養，建立體外模型，發現NB通過脂質過氧化反應對HK－2細胞造成損傷。細胞損傷是引起結石的關鍵因素，腎小管上皮細胞損傷脫落后暴露的基底膜可以吸引結晶的黏附，而壞死的細胞碎片會進一步富集參與形成結石，從而導致腎結石的發生發展［21，22］。 在 6 h、12 h 和 24 h 三個時間點，四環素干擾組中HK－2損傷程度及晶體黏附量均顯著小于NB組，表明四環素可以抑制NB對HK－2細胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留。這一結果進一步確認了四環素在腎結石的預防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB可損傷HK－2細胞，損傷程度和晶體滯留程度與NB作用時間成正比，四環素可以抑制這一過程。因此，NB可能通過以下途徑導致腎結石的形成：NB感染損傷腎小管上皮細胞后，晶體向暴露的基底膜黏附，與NB和壞死細胞碎片共同形成結石。因此運用四環素或其他抗菌藥物滅殺NB可能是預防和治療結石的一個新的方向。