Lactobacillus plantarum YS-2對葡聚糖硫酸鈉誘導C57BL/6J小鼠結腸炎的抑制作用

騫 宇,雷愛玲,劉曉敬,易若琨,趙 欣

(重慶第二師范學院生物與化學工程學院,重慶市功能性食品協同創新中心,重慶市功能性食品工程技術研究中心,功能性食品研發重慶市工程實驗室,重慶 400067)

牦牛酸乳是我國青藏高原地區少數民族牧民經常食用的一種自然發酵乳制品,其含有各類營養成分,具有多種生物活性作用,是一種優質的天然食品[1]。牦牛酸乳的品質受到原料和發酵環境的影響,特別是不同環境下發酵微生物的差異對品質產生較大影響,因此不同地區牦牛酸乳的抗氧化能力、調節免疫力作用均有一定差異[1-2]。牦牛酸乳由于特殊的發酵環境和特殊的發酵工藝,其微生物組成與一般乳酸有較大差異[3],牦牛酸乳中含有大量乳酸菌,對其進行深入的分離鑒定可分離出具有益生菌潛質的優質乳酸菌[4-5]。

潰瘍性結腸炎(UC)是一種發病率較高的炎癥性腸病,通過動物模型研究食品對潰瘍性結腸炎的作用效果和機制是常用的方法[6]。其中葡聚糖硫酸鈉(DSS)造模可以形成類似臨床的潰瘍性結腸炎表現,是最為理想的潰瘍性結腸炎模型[7]。腸道出現UC損傷后,乳酸菌在腸道中發揮其抗氧化作用,清除腸道內的自由基能夠緩解UC[8]。腸道逐漸出現炎癥狀態時腸黏膜通透性將發生變化,炎癥加劇時,腸黏膜通透性也將大幅度提高[9-10]。研究顯示植物乳桿菌BLP可通過改善腸黏膜通透性緩解DSS誘導的結腸炎[11]。臨床研究也報道乳酸菌在UC藥物治療期間能夠有明顯的協助作用,可以有效地加強治療效果[12]。乳酸菌通過多種途徑對UC起到緩解作用,但是對其機制的研究還缺乏深入研究。同時,本研究團隊從牦牛酸乳中分離鑒定出了新的乳酸菌菌種,其作用機制也有待進一步研究。

本研究以從青海玉樹藏族自治州的自然發酵牦牛酸乳中分離鑒定的乳酸菌LactobacillusplantarumYS-2(LP-YS2)為研究對象,觀察LP-YS2對DSS誘導結腸炎的抑制作用。利用包括分子生物學方法,特別是觀察結腸相關基因表達的變化,檢測LP-YS2對結腸炎實驗動物的影響,驗證LP-YS2對DSS誘導結腸炎的抑制效果,為深入利用LP-YS2積累理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七周齡雄性C57BL/6J小鼠 購自于重慶醫科大學實驗動物中心(許可證號:SYXK(渝)2012-0001);LactobacillusplantarumYS-2 由本研究組分離自青海玉樹自然發酵牦牛酸乳中,保藏于中國典型培養物保藏中心(保藏號:CCTCC M 2016748);MRS肉湯培養基 北京索萊寶科技有限公司;柳氮磺胺吡啶、葡聚糖硫酸鈉(DSS,分子量40 kDa) 美國Sigma公司;內皮素(ET)、生長抑素(SS)、P物質(SP)、血管活性腸肽(VIP)測定試劑盒 北京普爾偉業生物科技有限公司;IL-2、IL-10血清細胞因子測定試劑盒 美國BioLegend公司;髓過氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;SYBR Green PCR Master Mix 美國賽默飛公司;逆轉錄試劑盒、qPCR引物 北京天根生化科技有限公司;其余試劑 均為國產分析純；MRS液體培養基 48 g MRS肉湯培養基加熱溶解于1 L蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌 15 min。

Biomate3S紫外可見光分光光度儀、A200PCR儀、LUX多功能性酶標儀、Stepone plus熒光定量PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;ICEN-24R高速冷凍離心機 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌種準備 接種LactobacillusplantarumYS-2菌種在MRS液體培養基(48 g MRS肉湯培養基加熱溶解于1L蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌 15 min)中36 ℃培養24 h,然后離心分離(3000 r/min,10 min),棄去上層培養基,加入生理鹽水與下層乳酸菌混勻,調節濃度至1×108CFU/mL和1×109CFU/mL,以備動物實驗進行灌胃。

1.2.2 動物實驗 小鼠飼養于室溫(25±2) ℃、相對濕度(50%±5%)的環境中,同時保持飼養環境每12 h調節光/暗。適應飼養一周后選擇50只體重(25±2) g的C57BL/6J小鼠,將小鼠分為5組,分別為正常組、模型組、LP-YS2-L組(低濃度LP-YS2灌胃組)、LP-YS2-H組(高濃度LP-YS2灌胃組)和柳氮磺胺吡啶組(陽性對照組)。實驗周期5周,實驗過程中,正常組小鼠給予自由攝入飲水和飲食,同時每日灌胃0.2 mL生理鹽水;除正常組小鼠外,其余各組小鼠在第3周和第5周分別給予2%和4%(w/v)的DSS水溶液,其余時間給予自由攝入飲水和飲食;LP-YS2-L和LP-YS2-H組小鼠除給予自由攝入飲水和飲食外每日灌胃0.2 mL的1×108CFU/mL和1×109CFU/mL的LP-YS2;柳氮磺胺吡啶組小鼠除給予自由攝入飲水和飲食外每日按濃度20 mg/kg bw灌胃柳氮磺胺吡啶[13]。5周后實驗結束后采用斷頸法處死小鼠,然后測定小鼠結腸的質量和長度,同時取血和結腸組織待用。

1.2.3 小鼠血清ET-1、SS、SP和VIP水平測定 取小鼠血漿后在4500 r/min條件下離心分離15 min分離得到血清,然后按試劑盒方法測定血清和結腸組織中ET-1、SS、SP和VIP的水平[14]。

1.2.4 小鼠血清中IL-2和IL-10細胞因子水平的測定 按1.2.3方法對小鼠結腸血漿進行處理得到血清,然后按試劑盒方法測定小鼠血清中的IL-2和IL-10細胞因子水平[14]。

1.2.5 小鼠結腸組織中MPO、SOD含量和GSH、MDA活力的測定 結腸組織與生理鹽水按照質量比1∶9混合后用超聲粉碎將結腸組織進行勻漿處理,然后按試劑盒方法測定結腸組織中MPO、SOD的活力和GSH、MDA含量[14]。

1.2.6 qPCR實驗測定小鼠結腸組織mRNA表達 將小鼠結腸組織打碎,然后用RNAzol提取結腸組織的總RNA,并將提取到的總RNA濃度稀釋到1 μg/μL。取5 μL稀釋后的總RNA提取液,按逆轉錄試劑盒方法進行逆轉錄得到cDNA模板。取2 μL的cDNA模板,和10 μL的SYBR Green PCR Master Mix、上下游引物(表1)各1 μL進行混合,在反應條件95 ℃,60 s后再進行40個循環:95 ℃,15 s;55 ℃,30 s;72 ℃,35 s;然后95 ℃,30 s;55 ℃,35 s進行檢測,并以GAPDH為內參,根據公式2-ΔΔCt=ΔCt(檢測基因)-ΔCt(GAPDH)計算基因的相對表達量[15]。

表1 逆轉錄聚合酶鏈反應引物序列

1.3 數據分析

將3次的實驗結果取平均值,然后使用統計軟件SAS9.1利用one-way ANOVA方法對各組實驗結果在p<0.05 水平上是否具有顯著差異進行分析。

2 結果與討論

2.1 LP-YS2對結腸的作用

DSS誘導小鼠結腸炎后小鼠出現便血及體重下降,同時解剖后觀察到小鼠結腸長度變短及出現腫大,判斷為造模成功[16]。實驗結果顯示模型組小鼠的結腸長度最短,正常組小鼠最長;同時模型組小鼠的結腸質量/結腸長度也最低,正常組小鼠最高(表2)。研究證實DSS誘導的結腸炎小鼠其結腸質量和結腸長度與正常小鼠均出現差異,總結之前的研究,可用結腸質量/結腸長度的比值作為實驗性潰瘍性結腸炎程度的重要評價標準。由實驗結果可以看出,LP-YS2-H可以顯著(p<0.05)緩解DSS誘導結腸炎造成的結腸長度和結腸質量/結腸長度比值降低,且效果與20 mg/kg bw灌胃量的藥物柳氮磺胺吡啶接近,同時效果顯著優于LP-YS2-L(p<0.05)。

表2 各組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度比值

2.2 LP-YS2對小鼠血清ET-1、SS、SP和VIP水平的作用

由表3可以看出正常組小鼠血清中的SS和VIP水平均高于其余各組,而ET水平則低于其余各組;模型組小鼠則顯示出相反的情況,其小鼠血清中ET和SP水平最高,而SS和VIP水平最低。相對于模型組,LP-YS2可以顯著(p<0.05)提高結腸炎小鼠血清中的SS和VIP水平和顯著降低ET和SP水平,且高濃度LP-YS2(LP-YS2-H)的效果更好,接近于藥物陽性對照柳氮磺胺吡啶組。研究表明內皮素的血管收縮作用可以引起結腸黏膜的糜爛,甚至潰瘍,能加劇結腸炎[17-18]。SS能夠通過抑制胃酸等胃腸液的分泌減輕胃腸炎癥,SS的減少將加劇胃腸液的分泌,加重結腸炎[19]。P物質是細神經纖維內的一種神經肽,能夠調節神經系統與免疫系統,P物質的大量積累可加劇結腸炎的程度[18]。同時過量的P物質可誘發結腸炎,拮抗動物體內P物質后能緩解結腸炎[20]。VIP能夠抑制機體內iNOS的轉錄,避免結腸組織中過量的iNOS轉化成NO,從而導致腸黏膜的損傷;也能夠控制結腸炎對免疫系統紊亂[19-21]。通過抑制ET、SP水平和增加SS、VIP水平能夠緩解結腸炎,本研究中LP-YS2可以通過以上作用起到抑制潰瘍性結腸炎的作用。

表3 各組小鼠血清的ET、SS、SP和VIP水平

2.3 LP-YS2對小鼠血清IL-2和IL-10細胞因子水平的作用

由表4可知,模型組小鼠血清的IL-2細胞因子水平顯著(p<0.05)低于其余各組小鼠;在LP-YS2作用下,LP-YS2-H和LP-YS2-L組小鼠血清的IL-2細胞因子水平顯著提高(p<0.05),并且LP-YS2-H作用下IL-2水平略低于藥物柳氮磺胺吡啶的作用。相反的,模型組小鼠血清的IL-10水平最高,正常組小鼠最低,LP-YS2-H作用下小鼠的IL-10水平僅低于藥物物柳氮磺胺吡啶組和正常組小鼠。IL-2是Th2細胞分泌的細胞因子,與UC直接相關;Th2細胞介導免疫反應影響UC,IL-2在過程通過影響Th2細胞起到抑制炎癥的作用,減輕UC程度[22-24]。IL-10是具有免疫抑制作用的Treg細胞分泌的細胞因子,能夠促進結腸炎的發展[24];LP-YS2能夠提升IL-2水平和降低IL-10水平,通過調控機體免疫系統緩解結腸炎。

表4 各組小鼠血清細胞因子IL-2和IL-10水平的影響

2.4 LP-YS2對小鼠結腸組織MPO、SOD活力和GSH、MDA含量的作用

由表5可知,正常組小鼠結腸組織中的GSH含量和SOD活力最強,MPO活力和MDA含量最弱,體內保持正常的氧化水平,未見自由基對機體造成損傷;DSS誘導結腸炎后,GSH含量和SOD活力顯著(p<0.05)下降,而MPO活力和MDA含量則顯著(p<0.05)上升。LP-YS2和柳氮磺胺吡啶可以顯著(p<0.05)抑制DSS造成的GSH含量、SOD活力下降和MPO活力、MDA含量上升。同時,相對于模型組小鼠高濃度的LP-YS2(LP-YS2-H)能夠更顯著(p<0.05)的上升小鼠結腸組織的GSH含量、SOD活力和下調MPO活力、MDA含量。結腸病變發生炎癥后組織中中性粒細胞聚集開始下降,大量中性粒細胞內流進入組織使MPO活力大幅度提高[25],同時ROS和RNS等自由基大量聚集,進一步使結腸組織發生損傷和毒性反應,加劇結腸炎[26]。實驗和臨床研究都證實發生結腸炎后,結腸組織中的GSH含量和SOD活力大幅度降低,同時過氧化產物MDA則大幅度上升[27-28],由此證實控制自由基在組織中的聚集,增強抑制氧化的酶活力,可以起到抑制結腸炎的作用。本研究的實驗結果也證實UC導致SOD活力和GSH含量下降,而MPO活力和MDA含量增強,LP-YS2可顯著(p<0.05)抑制UC對結腸造成的氧化應激反應,抑制結腸炎。

表5 各組小鼠結腸組織的MPO、GSH、MDA和SOD活力

2.5 LP-YS2對小鼠結腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達的作用

由表6可知,DSS誘導結腸癌后可導致小鼠結腸中nNOS和eNOS的mRNA相對表達量下降,而iNOS相對表達量上升。LP-YS2可上調DSS誘導結腸炎小鼠結腸組織中的nNOS和eNOS相對表達量和下調iNOS的相對表達量,且LP-YS2-H上調nNOS和eNOS相對表達量和下調iNOS的相對表達量顯著(p<0.05)強于LP-YS2-L,LP-YS2-H作用小鼠結腸的nNOS、eNOS和iNOS相對表達量略低于柳氮磺胺吡啶20 mg/kg bw灌胃作用小鼠的相對表達量。有研究顯示eNOS可以控制產生適量的NO,從而保持結腸組織處于正常狀態,對結腸炎引起的結腸損傷有重要的控制作用;iNOS則能轉化出大量的NO,過量的NO對結腸組織的損傷具有副作用,加劇結腸的損傷[29]。nNOS也可以控制NO在組織中的濃度,維持組織不受到過量NO的侵害,同時nNOS還可以控制iNOS的過量表達,抑制炎癥[29-30]。本研究中LP-YS2-H組小鼠由于受到LP-YS2-H的作用,上調了結腸中nNOS、eNOS表達和下調了iNOS表達,對結腸炎起到了抑制作用。

表6 LP-YS2對小鼠結腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達的作用

2.6 LP-YS2對小鼠結腸組織c-Kit和SCF mRNA表達的作用

由表7可知,正常組小鼠結腸組織中c-Kit和SCF的mRNA相對表達強度最高,模型組小鼠結腸中的c-Kit和SCF相對表達強度最低。LP-YS2-H組小鼠結腸中的c-Kit和SCF相對表達強度顯著(p<0.05)高于LP-YS2-L組和模型組小鼠,低于柳氮磺胺吡啶組和正常組小鼠。UC導致結腸功能紊亂,結腸動力降低,UC導致正常的Cajal間質細胞數量降低,使結腸動力下降,與UC進程直接相關[31]。c-Kit和SCF對保持Cajal間質細胞數量有重要的作用,SCF/Kit 信號途徑受損后,Cajal間質細胞不僅數量下降,Cajal間質細胞的增殖也將受到影響,使UC的癥狀加劇[32]。實驗結果表明LP-YS2可通過上調結腸組織中c-Kit和SCF的表達抑制DSS誘導的結腸炎。

表7 LP-YS2對小鼠結腸組織c-Kit和SCF mRNA表達的作用

2.7 LP-YS2對小鼠結腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達的作用

由表8可知,DSS誘導結腸炎模型組小鼠結腸的IL-8和CXCR2 mRNA相對表達量最高,正常組小鼠結腸的相對表達量最低。藥物柳氮磺胺吡啶組小鼠結腸的IL-8和CXCR2相對表達量僅高于正常組,低于其余各組。LP-YS2-H組小鼠結腸的IL-8和CXCR2相對表達量則顯著(p<0.05)低于LP-YS2-L組和模型組小鼠。IL-8是一種中性粒細胞趨化和活化因子,可以介導多種途徑誘發的炎癥反應,包括能介導UC的炎癥[33]。CINC-1是IL-8家族中的一種中性粒細胞趨化因子,CXCR2是CINC-1的受體,CXCR2能夠起到介質作用來調控器官間相互作用,降低CXCR2在組織中的含量有助于減輕UC造成的結腸損傷[34-35]。LP-YS2可以顯著下調結腸炎小鼠結腸中的IL-8和CXCR2 mRNA表達,從而抑制結腸炎。

表8 LP-YS2對小鼠結腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達的作用

3 結論

本研究采用DSS誘導小鼠結腸炎動物模型對從自然發酵牦牛酸乳中分離到的乳酸菌LP-YS2的結腸炎抑制效果進行了體外研究。通過對小鼠血清和結腸組織的觀察,實驗結果顯示相對與結腸炎模型組小鼠,LP-YS2可以抑制結腸炎對小鼠造成的影響,緩解結腸炎,使小鼠機體各項指標向正常狀態轉換。由此可以看出,LP-YS2可以抑制DSS誘導的結腸炎,濃度與效果呈正相關,高濃度LP-YS2的作用更為強烈。LP-YS2是一種具有結腸炎抑制效果的優質乳酸菌,有待進一步開發利用。