植物乳桿菌發酵乳對小鼠降膽固醇作用

裘迪紅,黃麗華,陳哲科,王妮妮,戴 苡,鐘要紅

(杭州醫學院,浙江杭州 310053)

目前,慢性病已經是全球人類健康的重大問題,動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病已嚴重威脅著人類的健康,血清中高膽固醇含量是引起眾多心血管疾病的重要因素之一,甚至成為導致死亡的首要因素[1]。目前雖然有許多用于降低膽固醇的藥物,但人們更希望能夠通過非藥物途徑來達到降低膽固醇含量的目的。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬,是人體胃腸道的土著菌群,植物乳桿菌具有維持腸道內菌群平衡[2]、降低膽固醇水平[3]、提高機體免疫力、促進營養物質吸收[4]等多種功能。利用益生菌降低食品和人體血清中的膽固醇,是近20年來隨著人們對營養與健康要求的逐漸提高才發展起來的一項新的研究課題,其應用價值也正被越來越多的研究者和企業所看好。因此,國內外學者對植物乳桿菌的分離鑒定及其益生特性進行了大量的研究,植物乳桿菌降低血清中膽固醇的益生特性尤其引人注目,Jeun等研究了植物乳桿菌的降血脂功能,Lye等研究植物乳桿菌的降血脂功能及其機理,Jafari等研究了植物乳桿菌發酵乳的降膽固醇效果[5-7]。冉冉在藏靈菇源酸奶復合菌發酵劑對大鼠降膽固醇的研究中發現植物乳桿菌對大鼠血清膽固醇有顯著的降低作用[8],王俊國在植物乳桿菌LIP-1對高脂血癥大鼠血脂的調節作用的研究中也發現植物乳桿菌有降血脂的功能[9]。更多的研究者開始關注植物乳桿菌產品的開發以及機理的研究。目前,國內市場尚未出現以降膽固醇功能為主的功能性發酵乳,因此開發降膽固醇發酵乳,對高脂血癥的人群進行營養干預,以期達到降低血脂、預防心血管疾病的目的,是預防慢性病的一條途徑。

本實驗從從泡菜中分離出一株體外膽固醇降解率為45%的植物乳桿菌,經過牛乳發酵的風味研究發現,該菌在牛乳培養基中能產生獨特的風味,因此把該菌應用到降膽固醇發酵乳的制備中。為縮短發酵時間,采用混合乳酸菌發酵制備發酵乳,為了解其降血脂功能,采用高血脂模型小鼠研究發酵乳在體內的降血脂功能,以期為將來降膽固醇乳制品的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛乳 蒙牛牌,購于超市;菌種 植物乳桿菌,實驗室分離鑒定獲得;商業發酵劑(嗜酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌) 北京川修科技有限公司;昆明雄性小鼠 6周齡,體重38～44 g,許可證號SCXK(滬)2012-0002,上海斯萊克實驗動物有限責任公司;動物房條件 溫度(20±2) ℃,濕度78.5%,每天12 h光照,12 h黑暗;基礎飼料配方(W/W):面粉20%,米粉10%,玉米20%,麩皮25%,豆料20%,骨粉2%,魚粉;高脂飼料配方(W/W):基礎飼料83.8%,膽固醇1%,豬油10%,牛膽鹽0.2%,蛋黃5%;MRS肉湯培養基 航景生物科技有限公司。

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量試劑盒 德賽診斷系統(上海)有限公司;0500790S日立7020全自動生化分析儀 上海曼普生物科技有限公司。PL4002電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H-205R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養箱 上海瀘西分析儀器廠有限公司;HWS恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠;LDZX-50KB立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;紫外分光光度計、FE20實驗室PH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-8D型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒溫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌發酵液的制備 取 0.4 mL活化的植物乳桿菌于10 mL MRS肉湯培養基中,37 ℃搖床培養至菌體濃度約為107～108cfu/mL。

1.2.2 發酵乳的制備 混合菌發酵:新鮮牛乳預熱到70 ℃,于40 MPa下均質,95 ℃殺菌5 min冷卻至37 ℃,按比例加入植物乳桿菌和商業發酵劑發酵,植物乳桿菌添加比例為2%(v/v),商業發酵劑的添加量為0.05%(v/v),37 ℃靜止培養,14 h后停止發酵,測定發酵乳的pH,同時用選擇培養基測定植物乳桿菌活菌數。

1.2.3 高脂模型的建立和灌胃方法 動物分組和飼喂安排:小鼠自由飲水,基礎飼料飼喂一周后,按體重和TC平均分配原則將小鼠分成正常組、對照組和發酵乳組3 組,每組10 只。不同處理組喂食情況分別為:正常組:喂基礎飼料,每天每只灌胃0.4 mL生理鹽水;對照組:喂高脂飼料,每天每只灌胃0.4 mL生理鹽水;發酵乳組:喂高脂飼料,每天每只灌胃0.4 mL自制發酵乳。其中,正常組和對照組小鼠飼養14 d 后采血,檢測TC、TG,評價是否形成高脂血癥。小鼠飼養期間,每天保持充足的食物和飲水,期間每天記錄小鼠的體重和攝食量。

1.2.4 實驗動物的處理與檢測方法

1.2.4.1 體重、攝食量和飼料利用率的測定 小鼠飼養期間,每天定時稱量攝食量并記錄,每周稱一次體重,計算飼料利用率:飼料利用率(%)=體重/攝入量×100。

1.2.4.2 血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的測定 小鼠飼養28 d禁食12 h,眼眶靜脈叢采血,4 ℃冰箱靜置3 h,離心(3000 r/min,15 min,4 ℃),取血清,試劑盒測定小鼠血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

1.2.4.3 臟器指數的測定 末次灌胃24 h后,稱量體重,立即摘取心臟、肝臟、脾臟和腎臟,生理鹽水沖洗,濾紙吸干后稱重,與小鼠最終體質量的比值即為臟器指數。

1.2.4.4 肝臟TC、TG含量的測定 把肝臟0.5 g加入5 mL甲醇-氯仿(V/V=2∶1)進行研磨,用甲醇氯仿(2∶1)混合液收集,定容至10 mL后于45 ℃水浴1 h,于4 ℃離心(8000×g,10 min),取30 μL上清液,用試劑盒測定TC和TG含量。

1.2.4.5 安全性評價 小鼠采血處死后,無菌操作取出肝臟,稱重后,轉移到滅菌培養皿,4 ℃冷藏,30 min內測定肝臟組織中是否有乳酸菌。具體方法:無菌條件切取肝臟2 g,滅菌PBS緩沖溶液(pH6.8)懸浮,均質機均質,溶液涂布MRS平板,37 ℃厭氧培養72 h,觀察平板有無菌落。

2 結果與分析

2.1 發酵乳的制備

由于植物乳桿菌是營養缺陷型菌株,在牛乳中發酵能力差[10],而商業發酵劑的主要菌株是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌,具有較強的發酵能力,所以本實驗選擇混合發酵的方法,在傳統的發酵乳發酵過程中添加植物乳桿菌進行協同發酵,以此來提高植物乳桿菌的發酵能力。按植物乳桿菌添加比例為2%,商業發酵劑的添加量為0.05%,加入商業發酵劑和植物乳桿菌,37 ℃培養14 h后,所得發酵乳口感細膩,組織均勻,有酸奶獨特的風味,發酵乳中的植物乳桿菌的活菌數為106cfu/mL。

2.2 發酵乳對高脂血癥小鼠的影響

2.2.1 小鼠的高脂血癥模型的建立 如表1所示,在實驗14 d后,與正常組相比,對照組小鼠血清中TC、TG顯著升高(p<0.05),表明高脂模型誘導成功。

表1 正常組、對照組小鼠血清中的TC、TG含量

2.2.2 發酵乳對高脂小鼠的體重、攝食量、飼料利用率及臟器指數的影響 在整個喂養期間,三組小鼠毛色光潔,食欲正常,均未出現異常體征,未發生自然死亡。由表2和表3可知,發酵乳組小鼠的體重、攝食量、飼料利用率和臟器指數與正常組相比,無顯著差異(p>0.05),說明植物乳桿菌對小鼠沒有毒副作用。對照組的體重、攝食量和飼料利用率比其它兩組顯著增高(p<0.05)。這進一步說明了本實驗高脂模型建立成功。

表2 不同處理組小鼠的體重、攝食量和飼料利用率

表3 不同處理組小鼠的臟器指數(%)

2.2.3 發酵乳對高脂小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影響 從表4中可以看出,28 d喂養后,與對照組相比,發酵乳組小鼠血清中TC和TG含量顯著下降(p<0.05),分別降低了43.21%和40.31%,而LDL-C和HDL-C無顯著變化(p>0.05)。鄒華軍在發酵泡菜對高脂血癥大鼠的干預效果研究中也有類似的結論[11],但是二者降低程度不同。王俊國在植物乳桿菌LIP-1對高脂血癥大鼠血脂的調節作用中也發現植物乳桿菌有降血脂的功能,與本文不同之處是其LDL-C降低顯著(p<0.05),HDL-C升高顯著(p<0.05)。分析原因主要是植物乳桿菌降膽固醇的效果受很多因素的影響,在發酵乳中的植物乳桿菌與在脫脂乳中的植物乳桿菌由于培養基不同,降血脂的程度也會不同。

表4 不同處理組小鼠血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量(mmol/L)

2.2.4 發酵乳對高脂小鼠肝臟TC、TG 含量的影響 由表5可看出,實驗28 d后,與正常組相比,對照組肝臟的TC、TG顯著增加(p<0.05),與對照組相比,灌胃發酵乳組小鼠肝臟中TC、TG顯著下降(p<0.05),分別下降了48.95%和31.54%。這說明了飼喂植物乳桿菌發酵乳可以顯著減少膽固醇在高脂小鼠肝臟中的積存(p<0.05)。但是飼喂植物乳桿菌發酵乳的高脂小鼠中TC和TG含量仍明顯高于正常組(p<0.05),表明灌胃植物乳桿菌仍不能使高脂小鼠恢復到正常狀態。

表5 不同處理組小鼠肝臟中的TC和TG含量(mg/g)

2.2.5 肝臟的乳酸菌檢測 對實驗小鼠肝臟的乳酸菌檢測顯示,MRS平板上未發現乳酸菌菌落的形成,說明發酵乳在小鼠體內不會發生肝腸易位現象。

3 討論與結論

目前,許多國內外研究者對乳酸菌降低膽固醇的影響因素和機理進行了研究,觀點主要集中在以下3點:a. 乳酸菌菌體細胞能夠同化吸收膽固醇:體外研究表明,在厭氧的條件下,乳酸菌在含有膽鹽的高膽固醇培養基中生長時,菌體細胞可以同化吸收介質中的膽固醇,降低介質中膽固醇的含量。Grill[12]等發現在含有牛膽鹽的高膽固醇培養基中,厭氧條件下,食淀粉乳桿菌細胞具有較強的膽固醇同化能力,可以降低培養基中約50%的膽固醇。b. 乳酸菌降解結合態膽酸轉變為游離態膽酸,后者由于溶解度下降與膽固醇發生共沉淀反應,從而降低膽固醇含量。Klaver[13]等研究者認為,乳酸菌對膽固醇的降低作用是因為在酸性條件(pH<6.0)下,膽固醇與膽鹽形成了沉淀,從而降低了培養基中膽固醇的含量。人體內存在脫結合膽酸與膽固醇共沉淀現象,這一作用將阻止膽固醇進入血液循環,避免了血清中高膽固醇的出現。c. 其他理論。對雙歧桿菌的研究還發現,雙歧桿菌通過抑制人體內活化的T細胞,控制新形成的低密度脂蛋白LDL受體,有助于降低血清膽固醇水平[14]。植物乳桿菌降膽固醇的作用機理是復雜的,反映出來的降膽固醇的效果也是不一樣的。只有了解植物乳桿菌降膽固醇機理,才能最大程度地降低血清中的膽固醇。

本實驗利用從泡菜中分離的植物乳桿菌制備發酵乳,發酵劑與植物乳桿菌接種量分別為0.05%(V/V)和2%(V/V),發酵溫度為37 ℃,時間14 h,發酵乳具有清香、口感好的特點。經動物實驗發現發酵乳對高脂小鼠具有一定的降膽固醇效果,高脂小鼠血清中TC和TG含量顯著下降(p<0.05),而LDL-C和HDL-C含量無顯著變化(p>0.05)。發酵乳在小鼠體內不會發生肝腸易位現象。為了增強發酵乳對高脂小鼠的降膽固醇能力,提高植物乳桿菌的發酵能力,植物乳桿菌的代謝、降膽固醇機理是今后研究的重點,在此基礎上,優化發酵乳工藝條件,生產降膽固醇發酵乳,對高脂血癥人群進行營養干預,預防慢性病,提高全民的健康水平。