基于QuEchERS-GC/MS法測定母乳的咖啡因殘留量

◎ 趙璟悠，王 勇，舒翠霞，董 穎

（1.蘇州市公安局刑警支隊，江蘇 蘇州 215000；2.南京市公安局刑事科學技術研究所，江蘇 南京 210012；3.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

母乳喂養是世界衛生組織聯合國兒童基金會全力倡導的科學育兒方法，現今也越來越被廣大家庭重視和推崇[1]。因此，女性的哺乳期飲食也就成為育兒家庭普遍關注的重要主題，當前對于哺乳媽媽是否能夠攝入咖啡、茶、巧克力等含有咖啡因的食物眾說紛紜。咖啡因（Caffeine，咖啡堿）屬于甲基黃嘌呤生物堿，具有中樞興奮作用，大劑量或長期食用可能導致失眠、激動不安、心悸，甚至可引起驚厥[2]。而美國兒科學會（APP）及國際母乳協會則表示，每天攝入的咖啡因不超過300 mg并不會影響哺乳媽媽喂奶和寶寶健康[3]。

目前，母乳的檢測都是針對其營養成分，如蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質，尚無對攝入咖啡因的檢測，并且也尚無標準檢測方法[4-6]。根據文獻，咖啡因檢測的方法主要有高效液相色譜法[7]、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法[8]、毛細管電泳法[9]、紫外分光光度法以及電化學分析方法[10]等，其中常用的方法為色譜或色譜-質譜法。選擇合適的儀器方法能夠降低檢出限、提高靈敏度，而合適的前處理方法更直接關系分析的準確性和可靠性[11-12]。母乳含有幾千種生物性流體，相較于體外食品樣本，基質成分復雜且多樣[4]，若采用傳統的溶劑萃取法[6]則存在雜質干擾、有機溶劑消耗多等不足；若采用生物檢材處理方法[13]，如固相萃取則存在操作繁瑣耗時、目標物損失等不足。QuEChERS是近年來國際上最新發展起來的一種快速凈化技術[14]，具有回收率高、分析速度快、操作簡便、溶劑使用量少、污染小等優點。本研究建立了QuEChERS凈化，GC/MS法測定母乳中咖啡因殘留量的方法，并應用于實際母乳樣品的檢測，旨在為相關部門對母乳中的咖啡因做一步研究提供有益參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

①儀器；Aglient 7890A-5975C氣相色譜-質譜儀，eppendorf 5430型高速離心機，SK-1型快速混勻器，電子天平，eppendorf移液槍，15 mL高速離心管，Horizon miVac自動濃縮儀。

②材料與試劑；無水乙醇（色譜純，TEDIA）、無水甲醇（色譜純，TEDIA）、乙腈（色譜純，TEDIA）、無水MgSO4、PSA（德國 CNW）、咖啡因標準溶液（濃度為1 000 mg/L，購自北京芬格爾安科技有限公司）。

1.2 儀器工作條件

①色譜條件，HP-5 MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度，260 ℃；載氣為高純氦氣（純度不小于99.99%），流量1.2 mL/min；分流模式，分流比為20∶1；進樣量1 μL。升溫程序：初始溫度70 ℃，保持1 min；以20 ℃/min速率升溫至180 ℃，保持2 min；以10 ℃/min速率升溫至275 ℃，保持20 min。②質譜條件，電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；電子倍增電壓1 600 V；質量掃描，50～550 u；掃描方式，SCAN、SM；溶劑延遲3 min。

1.3 標準溶液的配制

分別精密移取1 000 mg/L標準咖啡因溶液1、10、20、50、100、200 μL定容于 1 mL進樣瓶中，用無水甲醇進行稀釋，得到1、10、20、50、100、200 mg/L的咖啡因系列標準溶液。

1.4 樣品前處理

準確移取1 mL母乳樣品置于15 mL離心管中，加入乙腈10 mL提取，同時添加無水MgSO4150 mg、PSA 50 mg凈化，振蕩、混勻10 min后置于高速離心機以6 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液轉移至10 mL玻璃試管，待濃縮揮干后，無水乙醇定容100 μL，供GC-MS測定。

2 結果與討論

2.1 提取方式的選擇

對于不同咖啡因制品測定的前處理方法一般包括ISO 10095：1992試樣處理[15]、溶劑提取、超聲萃取、水浴浸提等方法。對上述方法進行比較、優化、改進及篩選的相關研究表明，三氯甲烷超聲萃取法更為簡單快速且效果最佳[16]。對于痕量的咖啡因，本實驗比較了三氯甲烷超聲萃取法和QuEChERS凈化法這兩種提取方式：①取1 mL空白母乳樣品中添加50 μg咖啡因，加入10 mL三氯甲烷，超聲10 min，渦旋后離心取清液，重復上述步驟后合并清液，揮干定容。②取1 mL空白母乳樣品中添加50 μg咖啡因，加入乙腈10 mL提取，同時添加無水MgSO4150 mg、PSA 50 mg凈化，振蕩10 min后離心取上清液，揮干定容。2種提取方式所提樣品咖啡因色譜圖，如圖1所示。

圖1 2種提取方式所提樣品咖啡因色譜圖

由圖1（a）可以看出：三氯甲烷超聲萃取法無法有效去除蛋白質和油脂等雜質，導致提取率不佳、雜峰干擾嚴重，咖啡因色譜峰不明顯，影響分析定性；圖1（b）中QuEchERS法適用于富含多種雜質目標物的提取，因而雜質峰大大降低，目標物回收率高；使用乙腈溶劑，提取液處于上層移取時也不容易引入雜質。此外，該法還具有回收率高、操作簡單快速、溶劑使用量少的優點，故本實驗采用QuEchERS法對母乳樣品進行前處理凈化，去除蛋白質和油脂等雜質。

2.2 凈化條件的選擇

通過乙腈沉淀固然能除去母乳中的蛋白質，但對脂肪、水溶性、礦物質和維生素等基質的凈化效果不佳，而PSA對脂肪酸、有機酸、碳水化合物等極性雜質卻有極好的吸附能力，MgSO4可通過吸水降低大部分水溶性雜質在樣品提取液中的溶解度，達到進一步凈化的目的。本實驗對人工添加凈化和直接采用QuEchERS凈化管的不同方式做了比較：①電子天平稱取無水MgSO4150 mg和PSA 50 mg。 ② 凈 化 管 為PSA 50 mg、Carbon 50 mg和MgSO4150 mg。③凈化管為PSA 50 mg、C1850 mg和MgSO4150 mg。其中，C18能進一步吸附除去少量脂肪等非極性雜質，Carbon因具有較大的比表面積和較強的吸附力，可以吸附母乳的乳黃色減少有機物干擾，使得提取液澄清透明。與人工配比添加PSA 50 mg、MgSO4150 mg凈化處理相比，樣品經過②凈化管和③凈化管處理后的色譜雜質峰并無明顯的降低或減少。因此，兼顧經濟適用性原則，選擇人工添加PSA和無水MgSO4足以滿足檢測需要。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

按實驗1.3所示的咖啡因系列標準溶液，以咖啡因峰面積為縱坐標（Y），以相應的質量濃度為橫坐標（X）繪制曲線，在1～200 mg/L濃度范圍內，咖啡因峰面積和母乳中添加的咖啡因濃度呈良好的線性關系，見表1。線性方程為Y=120 179X+185 717，相關系數r=0.999 4。采用標準添加法，以信噪比（S/N）為3，確定母乳中咖啡因的檢出限為1.25 ng/mL，以信噪比（S/N）為10，確定母乳中咖啡因的定量限為3.50 ng/mL。

表1 不同的咖啡因母乳添加濃度與對應的峰面積表

2.4 方法回收率和精密度

選取陰性母乳樣品加入咖啡因系列標準溶液進行加標回收實驗，加入10、50、200 mg/L 3個水平濃度標準溶液，分別平行操作6次，計算回收率在70.2%～84.7%，相對標準偏差在1.89%～3.01%，說明該方法測定母乳中的咖啡因可行。

2.5 實際樣品的檢測

對飲用咖啡飲品（星巴克拿鐵330 mL）的哺乳期女性采集樣本，分別采集攝入后1、2、4、8、12 h的母乳樣品，按照本文實驗1.4的方法步驟進行測定，測得的咖啡因含量分別為270.6、139.32、71.98、13.52、3.76 mg/L，如圖2所示。5份樣品提取的離子色譜圖如圖3所示。對于哺乳期女性食用含有咖啡因食品是否對嬰兒有影響，醫學上尚無權威性的理論科學依據，該方法可為咖啡因在母乳中的代謝變化的研究做初步探索。

圖2 個體母乳攝入的咖啡因代謝趨勢圖

圖3 攝入后不同時間陽性母乳的提取離子色譜圖

3 結語

本文著重探討對前處理方法的選擇，通過文獻參考和實驗對比，確定QuEchERS是更為理想的前處理方法，從而建立了QuEchERS提取-氣相質譜聯用儀（GC/MS）定性定量分析母乳中咖啡因的新方法。實驗探討了提取和凈化條件，表明方法準確靈敏、操作簡單，檢測限及回收率均符合要求，可為開展母乳中咖啡因的檢測提供有效的檢驗方法。