超高效液相色譜-串聯質譜法測定奶粉和液體奶中的壬基酚

◎ 方 玲

（上海天祥質量技術服務有限公司，上海 200233）

壬基酚（NP）是一種公認的環境激素，具有雌激素類特性和生物毒性，其對生物體的不良作用包括對內分泌系統、生殖系統和免疫系統的影響以及致癌作用等[1-2]。而調查發現，壬基酚大量存在于嬰幼兒配方奶粉中，對于主要食用配方奶粉的嬰幼兒來說有著極高的安全風險，壬基酚在剛開始發育的嬰幼兒身上作用將更加明顯，可能對嬰幼兒的內分泌系統造成不可逆轉的影響，使得嬰幼兒性發育速度過快，免疫能力差[3]。近年來，國家對嬰兒配方食品安全監管日趨嚴格，除了定期對日常營養指標有抽檢外，一些嬰兒配方食品中可能存在的有毒及環境污染物質也列入風險監測，其中就包括近年人們越來越視和關注的壬基酚[4]。

目前，測定壬基酚殘留的文獻比較多，方法主要是氣相-氣質聯用法[5]和液相-質譜聯用法[6-8]等。本研究建立了另外一種超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）測定奶粉和液態奶中壬基酚的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用水，超純水；甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純），德國默克公司；乙酸乙酯（色譜純）、環己烷（色譜純），美國Fisher 公司；壬基酚標準品及同位素內標（純度＞99%），Dr. Ehrenstorfer GmbH，上海安譜公司代購。

1.2 主要儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀，美國Waters 公司TQS；分析天平，梅特勒-托利多；移液槍，Thermo；超聲儀，上海科導超聲儀器有限公司；凍干機，北京博醫康實驗儀器有限公司；超低溫冰箱（-80 ℃），Thermo；旋轉蒸發儀，BUCHI Labortechnik AG。

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 壬基酚標準中間液

準確移取1 000 μg/mL的壬基酚標準品100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度。該標準中間液的濃度為10 μg/mL，再移取100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度。該標準中間液的濃度為100 ng/mL。置于1～4 ℃冰箱保存，可保存6個月。

1.3.2 壬基酚內標標準中間液

準確稱取1 mg的壬基酚標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度。該標準儲備液的濃度為100 μg/mL。再準確移取100 μL的上述儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度。該標準中間液的濃度為1 μg/mL。再準確移取1 mL該儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度，該標準中間液的濃度為100 ng/mL。置于1～4 ℃冰箱保存，可保存6個月。用移液槍準確吸取上述標準貯備液適量，用乙腈稀釋，配制成一系列標準工作溶液，質量濃度范圍為0.5、1、2、5、10 ng/mL。

1.4 樣品處理

稱取奶粉樣品2 g到25 mL玻璃比色管中，用移液槍準確加入壬基酚內標標準中間液（100 ng/mL）100 uL，再用移液槍準確移取10 mL環己烷∶乙酸乙酯=1∶1于玻璃比色管中，渦旋混勻1 min后超聲20 min，靜置2 h，取上清液5 mL待GPC凈化。

GPC流動相為環己烷∶乙酸乙酯=1∶1，流速為5 mL/min，收集8～20 min流出的溶液于100 mL雞心瓶中，在40 ℃下，80 r/min旋蒸至近干，用1 mL乙腈復溶后，上機檢測分析。

牛奶試樣用-80 ℃冰箱預凍3～4 h后，放置于凍干機中，冷凍干燥至干，再按照上述奶粉樣品前處理方法進行處理。

所有用到的玻璃器皿均用環己烷∶乙酸乙酯=1∶1清洗兩遍，且須在臨使用前準備。

由于環境中普遍存在壬基酚，因此GPC凈化后的溶液須盡快旋蒸處理，避免放置時間過長。整個實驗用的試劑均須現配現用，處理后的試樣須盡快上機分析。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱，Waters Xbridge BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動相，A相為水，B相為甲醇；流速，0.3 mL/min；進樣量，5 μL；柱溫，40 ℃。梯度洗脫條件，見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件表

1.5.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負離子掃描模式；多反應監測（MRM）模式；源溫度350 ℃；毛細管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h，具體的離子采集參數，見表2。

表2 壬基酚質譜采集參數表

2 方法驗證

2.1 方法線性范圍與檢出限

在上述試驗條件下，配制NP的質量濃度0.5～10 μg/kg的系列標準工作液，內標濃度為5 μg/kg，將NP的定量離子的峰面積與內標的定量離子峰面積比對，繪制標準曲線，線性關系和相關系數見表3。以加標樣品中NP色譜峰的信噪比S/N=3對應的濃度為方法的檢出限（LOD），其檢出限為 1μg/kg，以加標樣品中NP色譜峰的信噪比S/N=10對應的濃度為方法的定量限，其定量限為 3μg/kg，靈敏度能夠滿足食品檢測的要求。

表3 NP的線性范圍、相關系數及檢出限、定量限表

2.2 方法回收率及精密度

在奶粉中添加20 μL濃度為100 ng/mL的壬基酚標準中間液，做10平行，按上述試驗條件進行處理和測定，內標法計算NP的回收率和相對標準偏差（RSD）。由表4可知，加標回收率為80%～95%，相對標準偏差＜10%，由此可見此方法回收率和精密度良好。樣品加標的離子色譜圖如圖1所示。

表4 奶粉中NP的加標回收率與相對標準偏差表

圖1 樣品加標的離子色譜圖

3 結論

本文該法建立了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定奶粉和液態奶中壬基酚的分析方法，檢出限為1 μg/kg，可以滿足配方奶粉及液態原料乳中壬基酚殘留量的需求，可以作為企業判斷是否有壬基酚污染的手段之一。由于壬基酚對嬰幼兒的發育有很嚴重的危害，由此相關部門對污染源展開了調查，結果顯示，嬰幼兒配方乳粉當中主要的壬基酚成分來自于奶粉的外包裝、加工過程以及原料，需加強對原料、包裝材料以及生成過程中的接觸材料中壬基酚含量的檢測及控制，不使用含有壬基酚成分的容器中和管道，通過更換不銹鋼材質的管道、容器及采用馬口鐵包裝從源頭上控制污染[3，9]。