針刺對甲基苯丙胺暴露雌性大鼠生殖發育的影響

李明哲,徐平,陳永生,韓清,徐鳴曙,張英杰,單春雷

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針刺對甲基苯丙胺暴露雌性大鼠生殖發育的影響

李明哲1,2,徐平2,陳永生3,韓清4,徐鳴曙1,張英杰1,單春雷2

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海中醫藥大學,上海 201203;3.上海市公安局物證鑒定中心,上海 200439;4.復旦大學附屬金山醫院,上海 201508)

建立甲基苯丙胺(MA)染毒雌性大鼠模型,動態觀察針刺干預對不同發育期雌性大鼠生殖發育的影響。60只雌性SD大鼠隨機分為7周齡針刺組(7WA組)、7周齡不治療組(7W組)、9周齡針刺組(9WA組)、9周齡不治療組(9W組)和正常對照組(N組),每組12只。以2.5 mg/kg的MA制備MA染毒大鼠模型。觀察肛殖距,卵巢、子宮重量和系數,血清激素水平變化。7W組與N組、7WA組比較,肛殖距明顯縮短,差異有統計學意義(＜0.01)。7W組血清LH水平與N組、7WA組比較,9W組與7WA組比較,差異有統計學意義(＜0.05)。7W組血清FSH水平與N組、7WA組、9WA組及9W組比較,9W組與N組、7W組比較,差異有統計學意義(＜0.05)。針刺干預可增加雌性MA染毒大鼠的肛殖距;提高其血清FSH、LH水平,可能對雌性大鼠MA暴露所致生殖發育功能有促進作用。

針刺療法;電針;甲基苯丙胺;肛殖距;卵泡刺激素;黃體生成素;物質相關紊亂;大鼠

甲基苯丙胺(methamphetamine, MA),俗稱冰毒,屬于苯丙胺類興奮劑(amphetamine type stimulus, ATS)的一種,是目前全球濫用最為猖獗的毒品之一,嚴重危害社會的健康發展。MA具有強大的神經興奮作用,可以導致心癮,控制和認知能力降低,還能引起月經紊亂、停經,性功能減退,導致生殖內分泌功能紊亂,婦科疾病發病率增高等,嚴重危害女性的生殖健康,甚至累及其子代。

女性對苯丙胺較男性有更強的易感性,并且濫用呈低齡化趨勢。相對男性,成癮女性處于不同月經周期對可卡因或苯丙胺產生不同的主觀效應[1],表現為經量減少,甚至閉經,其紊亂程度與吸毒、多藥濫用的持續時間及藥量成正相關[2];吸毒對女性月經周期的影響是可逆的,但月經復來后經量增多及痛經發生的例數增多[3]。濫用甲基苯丙胺后55%的依賴者出現月經改變,其中37%出現明顯月經紊亂。激素紊亂類型與患者年齡、濫用時間及強戒隔離時間等存在明確聯系[4]。此外,如果整個孕期持續濫用,其子代所有的發育階段都會有明顯的延遲[5],尤其是當劑量達到2.5 mg/kg時,其子代中雄性的生殖器的距離會顯著縮短,無論雌性還是雄性的毛發出現和睜眼時間都會明顯縮短[6]。

目前,國內外對MA濫用的治療方法很少,尚無批準的治療藥物[7]。本課題組曾關注其影響學習、記憶及睡眠,采取針刺治療,療效顯著[8-9]。而對其導致生殖及內分泌紊亂的治療,尚無文獻報道。故本文用針刺干預治療MA依賴所致大鼠生殖及內分泌系統紊亂,以期為今后的臨床研究提供一定的依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

6周齡狀態良好、發育正常的健康清潔級SD大鼠60只,雌性,體重150～170 g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物房,許可證號為SYXK(滬)2013 -0109。飼養環境為晝夜12 h交替,室內溫度25℃,濕度50%～60%,食物和水自由攝取。實驗過程對大鼠的各種干預手段均按照科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物適應環境1周后,將所有雌性大鼠采用隨機數字表進行隨機分組。分為7周齡針刺組(7WA組)、7周齡不治療組(7W組)、9周齡針刺組(9WA組)、9周齡不治療組(9W組)和正常對照組(N組),每組12只。

1.2 模型制備

參照相關文獻[10]制備MA染毒大鼠模型。MA由上海市公安局物證鑒定中心提供,純度為98%,用0.9% NaCl溶解使用。給予MA染毒大鼠組腹腔注射MA (2.5 mg/kg),即按當日體重的0.25%給予。7WA組和7W組從7周齡第1天開始;9WA組和9W組從9周齡第1天開始,每日1次,連續注射7天,末次注射后30 min開始觀察大鼠活動情況,并記錄相關行為變化。所有染毒大鼠參照Sams-Dodd評分標準對大鼠的刻板行為進行評價[11],靜止,幾乎或根本沒有活動為0分;正?；顒?偶而有向前運動為1分;有活動伴隨并反復向前探索為2分;持續向前探索為3分;反復抬頭、搖頭或旋轉為4分;迅速搖頭、旋轉或帶搖頭的背腹運動為5分。每10 min評分1次,記錄刻板行為持續時間,以刻板行為評價≥2分,持續時間≥15 min為造模成功。

1.3 治療方法

1.3.1 N組

不進行抓取,沒有注射及干預。

1.3.2 7WA組和9WA組

造模后11周齡時根據《實驗針灸學》[12]取足三里、三陰交、關元,采用0.30 mm×25 mm一次性使用無菌針灸針進行針刺。關元針刺深度約0.5 cm,足三里、三陰交進針深度約0.3 cm,進針后小幅度捻轉。進針得氣后,雙側足三里接通G6805-Ⅱ低頻電子脈沖治療儀(上海醫用電子儀器廠生產),連續脈沖波,刺激頻率2 Hz,電流范圍在10～30 mA之間,20 min。針刺治療時動物處于相對自由狀態,不進行麻醉,治療者以手固定大鼠,使大鼠配合針刺,若針刺時針具脫落,則需再次針刺穴位,使針刺時間達到20 min。每周連續治療5 d,休息2 d,共治療10次,10次為1個療程。

1.3.3 7W組和9W組

只建立了染毒模型,沒有采用任何干預手段。

1.4 取材

為了保持各組間取材及數據的一致性,所有大鼠均在15周齡第1天時稱重,模型組大鼠腹腔注射MA(2.5 mg/kg)以染毒,染毒2 h后麻醉(10%的水合氯醛,4 mL/kg),N組直接麻醉,麻醉后取大鼠股動脈血5 mL。但由于9WA組是第一批染毒并且麻醉處死的,所以注射水合氯醛麻醉時意外死亡1只大鼠,因無法取到足量的動脈血,故舍棄該只大鼠的所有數據。考慮到可能是由于MA與水合氯醛同用的聯合反應,所以其他模型組采用2.5 mL/kg的劑量進行麻醉,無其他意外產生,N組大鼠仍然以4 mL/kg劑量進行麻醉。取血后分離子宮及卵巢,剔除子宮及卵巢內的多余脂肪。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠體重

對11周齡和15周齡的大鼠稱重,觀察各組MA染毒后體重變化。

1.5.2 肛殖距

在處死實驗動物前用游標卡尺(日本三豐Mitutoyo,530-512)測量各組的肛殖距。

1.5.3 子宮、卵巢重量和系數

取材后稱取子宮濕重、卵巢重量,并計算子宮、卵巢的臟器系數(臟器系數=臟器重量/體重×1000‰)。

1.5.4 血清激素檢測

處死前取大鼠股動脈血5 mL,室溫靜置1～2 h后臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)離心,取上清液,于﹣80℃保存備用。檢測前恢復至室溫,采用酶聯免疫吸附法檢測血清LH、FSH含量,采用相關試劑盒(上海源葉生物科技有限公司),具體操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行,統計數值為測試濃度×5倍。

1.6 統計學方法

應用SPSS24.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差表示,采用方差分析和檢驗,不符合正態分布采用秩和檢驗。以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

實驗期間,各組動物飲食、活動均正常,生長狀況良好。每次染毒后模型組大鼠均會出現刻板行為,表現為持續向前探索;反復抬頭、搖頭或旋轉及迅速搖頭、旋轉或帶搖頭的背腹運動。按照Sams-Dodd評分標準均＞3分,持續時間＞2 h(每次只觀察到染毒后2 h)。

2.2 各組大鼠MA染毒后體重變化比較

連續染毒7 d后,大鼠各組體重均隨時間延長而增長,組間差異無統計學意義(＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠MA染毒后體重變化比較 (±s,g)

2.3 各組大鼠治療后肛殖距比較

7W組與N組比較,肛殖距縮短明顯,差異有統計學意義(＜0.01);7W組與7WA組比較,肛殖距縮短明顯,差異有統計學意義(＜0.01)。

表2 各組大鼠治療后肛殖距比較 (±s,mm)

注:與7W組比較1)＜0.01

2.4 各組治療后卵巢、子宮重量和系數比較

各組治療后卵巢、子宮重量和系數比較,差異均無統計學意義(＞0.05)。詳見表3。

表3 各組治療后卵巢、子宮重量和系數比較 (±s)

2.5 各組治療后血清激素比較

7W組血清LH水平與N組、7WA組比較,差異有統計學意義(＜0.05);9W組血清LH水平與7WA組比較,差異有統計學意義(＜0.05);7W組血清FSH水平與N組、7WA組、9WA組及9W組比較,差異有統計學意義(＜0.05);9W組血清FSH水平與N組、7W組比較,差異有統計學意義(＜0.05)。詳見表4。

表4 各組治療后血清激素比較 (±s, mIU/mL)

注:與7W組比較1)＜0.05;與9W組比較2)＜0.05

3 討論

近年來,MA濫用問題越來越嚴峻,女性的濫用問題也越來越突出,其濫用人群為21～35歲的年輕女性[13];60.5%的女性濫用者在年齡小于18歲時開始濫用[14]。雌性大鼠的青春期為出生后第34～38 d,所以一般針對青春期的研究往往選擇6周齡的大鼠[15],為了更接近女性MA的真實濫用情況,本研究選擇建立7周齡(青春期,即性成熟期)及9周齡(生育期,即體成熟期)MA染毒大鼠模型。

成癮性藥物可使女性雌激素及孕激素長期處于低水平,從而導致下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂。女性對MA的敏感性與雌激素分泌相關,雌激素水平較高時,女性對MA更敏感。女性藥物濫用的后果還涉及到子女,影響圍產兒預后,早產、低體重兒、新生兒的發生率也與吸毒時間密切相關[16]。研究顯示,100620例產婦中有0.5%的是毒品依賴者,其中3.9%是MA依賴者[17];雌性大鼠在孕期皮下注射MA,其子代肛殖距和體長較其他組明顯縮短(＜0.01)[18]。

針刺可刺激經絡,調節下丘腦-垂體-性腺軸,提高血清中雌二醇(E2)、孕激素(P)、FSH、LH,改善排卵功能,從而促使紊亂的生殖及內分泌功能恢復正常[19-22]。研究顯示,深刺組與淺刺組均能降低LH水平,且深刺組下降幅度較淺刺組大,與安慰針組比較,差異有統計學意義(＜0.05)[23]。針刺治療女性內分泌紊亂歷史悠久,療效顯著,如張桂芝等[24]研究發現針刺治療126例海洛因依賴閉經的患者療效顯著,針刺的療效與吸毒和閉經時間顯著相關,閉經時間越長,療效越差;但對吸毒時間長者,針刺療效卻很顯著。吳鎏楨等[25]發現跨皮膚電刺激可促使海洛因成癮者性機能恢復,血清性激素LH和T水平顯著上升,減輕海洛因依賴者的戒斷癥狀,調節性機能。本研究選用足三里、三陰交和關元三穴,其中足三里為足陽明胃經合穴,胃的下合穴,具有溫補脾胃、益氣養血、扶正培元的功效;三陰交為肝腎脾三陰經的交會穴,可調理肝脾腎三臟、理氣活血、濡養胞宮;關元穴是任脈與足太陰脾經、足厥陰肝經、足少陰腎經的交會穴,任脈起于胞中,主胞胎,可培腎固本、健脾、調理沖任。三穴同用能增強補腎、健脾、調沖任作用,調整機體陰陽氣血平衡,使腎-天癸-沖任-胞宮軸功能正常運行,以恢復正常的生殖發育功能。

本研究顯示,雌性大鼠MA暴露對其生殖內分泌系統產生一定的影響。7W組與N組比較,肛殖距縮短明顯,差異有統計學意義(＜0.01)。7W組血清LH水平與N組比較差異有統計學意義(＜0.05)。7W組血清FSH水平與N組、9W組比較,9W組與N組比較,差異有統計學意義(＜0.05)。針刺治療對其紊亂的生殖內分泌功能有調節和改善的作用。7WA組與7W組比較,肛殖距增長明顯,差異有統計學意義(＜0.01)。7WA組與7W組、9W組比較,血清LH水平明顯升高,差異有統計學意義(＜0.05)。7WA組與7W組比較,血清FSH水平明顯升高,差異有統計學意義(＜0.05)。

綜上所述,針刺干預可增加雌性MA染毒大鼠的肛殖距;提高其血清FSH、LH水平,可能對雌性大鼠MA暴露所致生殖發育功能有促進作用。但由于本研究樣本量較小,檢測指標較少,不能充分闡明MA暴露對雌性大鼠生殖內分泌紊亂的作用機制及針刺的干預作用,但值得后續進一步采用大樣本、多維度的相關基礎研究。

[1] 葉桂萍,周文華.藥物濫用的性別差異及神經生物學機制[J].中國藥物依賴性雜志,2011,20(1):13-17.

[2] 胡秀香,汪鴻聲,張淑琴,等.多藥濫用對女性海洛因依賴者月經周期影響的調查[J].中國熱帶醫學,2006,6 (7):1294-1295.

[3] 鄒小蘭,盧秋芬.藥物濫用對女性月經周期的影響[J].中國藥物依賴性雜志,2005,14(1):60-61.

[4] 沈雯雯,張宜生,劉昱,等.甲基苯丙胺導致女性性腺功能和性激素調節的長期紊亂[J].中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(3):458-459.

[5] Rüedi-Bettschen D, Platt DM. Detrimental effects of self-administered methamphetamine during pregnancy on offspring development in the rat[J]., 2017,177:171-177.

[6] McDonnell-Dowling K, Donlon M, Kelly JP. Metham- phetamine exposure during pregnancy at pharmaco- logical doses produces neurodevelopmental and behavioural effects in rat offspring[J]., 2014,35:42-51.

[7] 石晶晶,吳寧,李錦.苯丙胺類興奮劑成癮的治療藥物研究現狀[J].中國藥物依賴性雜志,2016,25(2):145 -150.

[8] 李明哲,徐平,李煜,等.針刺干預甲基苯丙胺戒斷者記憶障礙的ERP觀察[J].上海針灸雜志,2013,32 (8):633-635.

[9] 李明哲,李煜,徐平,等.針刺對甲基苯丙胺依賴者睡眠障礙和焦慮、抑郁情緒的影響[J].上海針灸雜志, 2014,33(11):993-995.

[10] 王峰,黃宏平,朱慶春,等．甲基苯丙胺對大鼠認知和腦電圖的影響[J].中國法醫學雜志,2011,26(4):288- 290.

[11] 徐靜,周曉莉,張浩,等.甲基苯丙胺染毒動物模型的建立與評價[J].法醫學雜志,2009,25(4):282-284.

[12]林文注.實驗針灸學[M].上海:上海科學技術出版社, 1994:288-289.

[13] Akhgari M, Mobaraki H, Etemadi-Aleagha A. Histopa- thological study of cardiac lesions in methamphetamine poisoning-related deaths[J]., 2017,25(1):5.

[14] Saw YM, Saw TN, Yasuoka J,. Gender difference in early initiation of methamphetamine use among current methamphetamine users in Muse, Northern Shan State, Myanmar[J]., 2017,14(1):21.

[15] 劉長云,辛毅,丁艷,等.外源性雌激素對青春期前雌性大鼠性發育的影響[J].環境與健康雜志,2011,28 (7):634-635.

[16] 陳夢嘉,周文華.甲基苯丙胺成癮對女性和子代的危害[J].中國藥物依賴性雜志,2012,21(5):328-332.

[17] Saleh Gargari S, Fallahian M, Haghighi L,. Maternal and neonatal complications of substance abuse in Iranian pregnant women[J]., 2012,50(6):411- 416.

[18] McDonnell-Dowling K, Kelly JP. Does route of metham- phetamine exposure during pregnancy have an impact on neonatal development and behaviour in rat offspring[J]., 2016,(49):14-22.

[19] Eshkevari L, Mulroney SE, Egan R,. Effects of acupuncture, RU-486 on the hypothalamic-pituitary- adrenal axis in chronically stressed adult male rats[J]., 2015,156(10):3649-3660.

[20] Zhu J, Chen Z, Zhu L,. Arginine vasopressin and arginine vasopressin receptor 1b involved in electroacupuncture-attenuated hypothalamic-pituitary -adrenal axis hyperactivity in hepatectomy rats[J]., 2016,19(5):498-506.

[21] Wei Y, Dong M, Zhong L, et al. Regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity and immunologic function contributed to the anti- inflammatory effect of acupuncture in the OVA-induced murine asthma model[J]., 2017,636:177- 183.

[22] Pirnia B, Pirnia K, Mohammadpour S,. The effectiveness of acupuncture on HPA functional in depressed patients under methadone maintenance treatment, a randomized double-blind sham-controlled trial[J]., 2018,36:62-63.

[23] 溫秀云,粟勝勇,周曉媚,等.穴位不同針刺深度對絕經過渡期患者生活質量和生殖內分泌的影響[J].中華中醫藥雜志,2017,32(10):4724-4729.

[24] 張桂芝,趙琪,馮秀娥,等.針刺治療海洛因依賴者的閉經[J].中國藥物依賴性雜志,2004,13(4):284-285.

[25] 吳鎏楨,崔彩蓮,韓濟生.2/100 Hz跨皮膚電刺激對男性海洛因成癮者性機能障礙及血清性激素水平的影響[J].中國中西醫結合雜志,2000,20(1):15-18,33.

Effect of Acupuncture on the Reproductive Development in Methamphetamine-exposed Female Rats

-1,2,2,-3,4,-1,-1,-2.

1.,200030,; 2.,201203,; 3.,200439,; 4.,201508,

By establishing methamphetamine (MA)-addicted female rat model, to dynamically observe the effect of acupuncture on the reproductive development of the female rats in different developmental stages.Sixty female Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a 7-week acupuncture group (7WAG), a 7-week non-treatment group (7WG), a 9-week acupuncture group (9WAG), a 9-week non-treatment group (9WG) and a normal control group (NG), with 12 rats in each group. The MA-addicted rat model was established by administration of MA at 2.5 mg/kg. The anogenital distance, weights of ovaries and uterus and the ratio, as well as changes in serum hormones were observed.Compared with the NG and the 7WAG, the anogenital distance in the 7WG was significantly shorter (＜0.01). In comparing the level of serum luteinizing hormone (LH), the 7WG was significantly different from the NG and the 7WAG, and the difference between the 9WG and the 7WAG was also statistically significant (＜0.05). In comparing the level of serum follicle-stimulating hormone (FSH), the 7WG was significantly different from the NG, 7WAG, 9WAG and 9WG, and the 9WG was significantly different from the NG and the 7WG (＜0.05).Acupuncture can increase the anogenital distance of MA-addicted female rats and their serum levels of FSH and LH. It may promote the reproductive development of MA-exposed female rats.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Methamphetamine; Anogenital distance; FSH; LH; Substance-related disorders; Rats

1005-0957(2018)09-1063-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.09.1063

2018-01-29

上海市衛生與計劃生育委員會項目(20144y0159)

李明哲(1985—),女,助理研究員,碩士,Email:xiaoming308@163.com

徐鳴曙(1978—),男,副研究員,碩士生導師,博士,Email:mingshuxu@163.com