榨菜中檸檬黃、日落黃測定的探討和改進

劉超，景贊，鄒沫君，馮慧，黃志勇，呂雪梅

(樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000)

榨菜是人們日常喜愛的醬腌菜，但近幾年一些不法商販為了使其顏色更鮮艷在其中超限量添加檸檬黃、日落黃等人工合成著色劑[1]。人工合成著色劑，常以苯、甲苯等為原料，先制備色素中間體，再將1種或者2種中間體進行磺化、偶合、縮合和偶氮化等化學反應而制成，人工合成著色劑不能提供人體所需的任何營養物質，且一些人工合成著色劑還會危害人體健康，如致泄性、致突性與致癌作用等[2]。檸檬黃、日落黃即是2種典型的人工著色劑。GB 5009.35-2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》[3]，采用聚酰胺吸附食品中的人工著色劑，并用乙醇胺溶液進行洗脫。聚酰胺對合成著色劑的吸附能力會受到溫度的影響，回收率較低。同時操作步驟復雜，不適合大批量樣品的處理。檸檬黃和日落黃均具有苯磺酸鈉結構，本試驗采用混合型弱陰離子交換柱，用于吸附檸檬黃和日落黃，采用氨化甲醇洗脫，簡化了步驟的同時，極大地提高了回收率，在國內尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

乙腈：色譜純，Fisher Chemical 提供，批號：75-05-8；甲醇：色譜純，Dikma提供，批號：67-56-1；乙酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司提供，批號：20140421；乙酸銨：優級純，天津市光復科技發展有限公司提供，批號：50166；無水乙醇：分析純，成都市科隆化學品有限公司提供，批號：2017041901；氨水：分析純，成都市科龍化工試劑廠提供，批號：2015051202。

1.2 標準物質

檸檬黃：德國Dr. Ehrensorfer GmbH提供，Lot：96938，純度：95.5%；日落黃：北京壇墨質檢科技有限公司提供，批號：T160092 純度：99.3%。

1.3 色譜條件

色譜柱：EC 250/4.6 NUCLEODUR C18Grauty 5 μm，流動相：A：甲醇；B：20 mmol/L乙酸銨；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；波長：254 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution

1.4 標準曲線的配制

1.4.1 標準儲備溶液的制備(1.0 mg/mL)

分別精密稱取10 mg檸檬黃、日落黃至2個10 mL容量瓶中，用pH 6的水溶液定容至刻度。

1.4.2 混合標準中間溶液(0.1 mg/mL)

分別吸取1 mL的檸檬黃、日落黃標準儲備溶液至10 mL容量瓶中，用pH 6的水溶液定容至刻度。

1.4.3 混合工作溶液的制備

分別吸取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的檸檬黃、日落黃混合標準中間溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。檸檬黃、日落黃濃度分別為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL。

1.5 樣品制備

提取：精密稱取樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入1%氨水溶液10 mL，渦旋提取60 s后，超聲提取30 min(功率：500 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫后，4500 r/min離心5 min，重復提取至提取液無色，合并上清液，用檸檬酸水溶液(20%)調節pH至6左右，待凈化。

凈化：取已活化好的Cleanert PWAX(150 mg/6 mL)固相萃取柱(依次用6 mL甲醇、6 mL pH 6～7的水活化)，加入提取液10 mL，開動真空泵，使溶液按照5 mL/min的速度流下。溶液完全流干后，依次用6 mL水(pH 4)、甲醇-乙酸(6∶4)、6 mL水(pH 6～7)淋洗。開動真空泵，使淋洗液完全抽干后，用6 mL 2%氨化甲醇洗脫，接收洗脫液，收集液于50 ℃氮吹儀吹干，1 mL水定容。0.45 μm的水相濾膜過濾，待測。

1.6 方法的檢出限與定量限

精密稱取空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入1%氨水溶液10 mL，渦旋提取60 s后，超聲提取30 min(功率：500 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫后，4500 r/min離心5 min，重復提取至提取液無色，合并上清液，用檸檬酸水溶液(20%)調節pH至6左右，待凈化。取已經活化好的Cleanert PWAX(150 mg/6 mL)固相萃取柱(依次用6 mL甲醇、6 mL pH 6～7的水活化)，加入提取液10 mL，開動真空泵，使溶液按照5 mL/min的速度流下。溶液完全流干后，依次用6 mL水(pH 4)、甲醇-乙酸(6∶4)、6 mL水(pH 6～7)淋洗。開動真空泵，使淋洗液完全抽干后，用6 mL 2%氨化甲醇洗脫，接收洗脫液，收集液于50 ℃氮氣吹干，1 mL水定容。過0.45 μm的水相濾膜過濾，作為空白溶液。用空白樣品溶液將混合標準工作液稀釋至產生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根據色譜圖測得信噪比，按S/N=3∶1、S/N=10∶1計算檢出限和定量限。

1.7 方法的準確性

低濃度加標回收溶液：精密稱取空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入一定量混合標準中間溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成2.0 μg/mL的質控樣品。

中濃度加標回收溶液：精密稱取空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入一定量混合標準中間溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成4.0 μg/mL的質控樣品。

高濃度加標回收溶液：精密稱取空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入一定量混合標準中間溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成8.0 μg/mL的質控樣品。

1.8 方法的精密度

精密稱取3個空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入一定量混合工作溶液，每個空白樣品中加入混合標準中間溶液0.04 mL，然后按樣品制備方法操作，供試品溶液連續進樣6針，計算峰面積RSD值。

1.9 方法的重復性

取濃度為4.0 μg/mL的質控(QC)樣品各6份經前處理后進樣分析，測得2種色素的峰面積，代入隨行的基質標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復性結果。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

圖1 日落黃標準曲線Fig.1 Standard curve of sunset yellow

圖2 檸檬黃標準曲線Fig.2 Standard curve of lemon yellow

精密稱取空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，準確加入10，20，40，60，80，100 μL混合對照品工作液，按上述方法進行前處理，即得檸檬黃、日落黃濃度范圍為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL的基質標準曲線。將10 mL混標注入高效液相色譜中，測定相應的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并列出標準曲線方程和線性范圍。

由圖1和圖2可知，檸檬黃、日落黃在1.0～10.0 μg/mL的濃度范圍內r值依次為0.9995，0.9997，均≥0.99，所以檸檬黃、日落黃線性范圍良好。選取1.0～10.0 μg/mL為本試驗的線性范圍。

2.2 專屬性、檢出限和定量限

目標化合物出峰處無干擾，色譜圖應清晰可見，檸檬黃、日落黃色譜圖見圖3。

圖3 檸檬黃、日落黃色譜圖Fig.3 Chromatogram of lemon yellow and sunset yellow

采用空白樣品加標準溶液的方法測定[4-8]，精密稱取空白樣品約2.0 g于50 mL塑料離心管中，按上述方法進行前處理，得空白樣品溶液，用空白樣品溶液將混合標準工作液稀釋至產生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。檸檬黃的方法檢出限為0.15 mg/kg，定量限為0.50 mg/kg；日落黃的方法檢出限為0.12 mg/kg，定量限為0.40 mg/kg。

2.3 方法的準確性

表2 不同濃度下的檸檬黃回收率結果(n=3)Table 2 Recoveries of lemon yellow at different concentration levels(n=3)

表3 不同濃度下的日落黃回收率結果(n=3)Table 3 Recoveries of sunset yellow at different concentration levels(n=3)

采用空白樣品加標準溶液回收法測定，取濃度分別為2，4，8 μg/mL的質控(QC)樣品3份經前處理進樣分析，每種濃度平行進樣3針，測得2種合成著色劑的峰面積，代入隨行的基質標準曲線，計算濃度，除以理論加入濃度，獲得方法的回收率，即準確度結果。

由表2和表3可知，檸檬黃、日落黃在低、中、高3個水平回收率均在80%～110%之間。低濃度回收率略低，隨著濃度的增大，回收率接近100%，這是因為在低水平時，系統誤差較大，隨著濃度的增加，系統誤差逐漸變小。

2.4 方法的重復性

表4 重復性測定結果(檸檬黃) Table 4 Repeatability (RSD) of lemon yellow

表5 重復性測定結果(日落黃) Table 5 Repeatability (RSD) of sunset yellow

取濃度為4.0 μg/mL的質控(QC)樣品各6份經前處理后進樣分析，測得2種色素的峰面積，代入隨行的基質標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復性結果。由表4和表5可知，檸檬黃、日落黃的重復性(RSD值)均<5%，表明方法的重復性良好。

2.5 方法的精密度

表6 精密度測定結果(檸檬黃)Table 6 Precision (RSD) of lemon yellow

表7 精密度測定結果(日落黃)Table 7 Precision (RSD) of sunset yellow

精密稱取3個空白樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入一定量混合工作溶液，每個空白樣品中加入混合標準中間溶液0.04 mL，然后按樣品制備方法操作，供試品溶液連續進樣6針，計算峰面積和RSD值。由表6和表7可知，檸檬黃、日落黃的精密度均<3%，表明儀器精密度良好。

3 結論

本試驗針對榨菜中檸檬黃、日落黃建立了高效液相色譜檢測方法。著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、方法的準確性、重復性、精密度等指標。結果顯示：該方法在1.0～10.0 μg/mL范圍內具有良好的線性；方法檢出限為檸檬黃：0.15 mg/kg、日落黃：0.12 mg/kg；添加濃度在2.0，4.0，8.0 μg/mL 3個水平條件下的平均回收率在80%～100%之間；2種合成色素的重復性<5%、精密度<3%。該方法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高、穩定性好、結果準確等特點，適用于榨菜中檸檬黃、日落黃的測定。