氟啶胺對斑馬魚胚胎線粒體氧化磷酸化和多巴胺系統基因表達的干擾效應

鄭珊珊，王曉紅，趙元慧

東北師范大學環境學院，長春 130117

氟啶胺是一種廣譜性氨基吡啶類農用殺菌劑，它是一種典型的線粒體氧化磷酸化解偶聯試劑[1-2]。該殺菌劑對水生生物和水生環境具有非常高的毒性[3]，因此氟啶胺產品的說明中明確提出該殺菌劑不能夠通過空中噴灑或灌溉系統施加，以防威脅到水生生態系統的安全。但是仍有少量報導指出氟啶胺被排放到水環境中[4-5]。目前，關于氟啶胺在水環境中實測濃度的相關報導非常少，但是有研究者根據氟啶胺的最大使用速率計算，該殺菌劑在地表水中的慢性長期濃度約為3.15 μg·L-1，而急性短期濃度最高可達18 μg·L-1[3]。此外，有研究者根據郁金香栽培中氟啶胺的實際應用量模擬了一個室內淡水微生態系統，結果表明微生態系統水環境中約有氟啶胺殘留量0.27～6.7 μg·L-1[5]。氟啶胺對魚類具有非常高的毒性，且在魚類體內能夠高度富集[3]，因此氟啶胺在水環境中的殘留仍然是備受關注的環境問題。

目前，很多證據表明，動物患帕金森病的原因之一是接觸農藥。該病的特征是動物體內多巴胺神經元死亡，且產生運動行為障礙[6]。帕金森病的發病機理與多巴胺神經細胞內的氧化脅迫和線粒體功能障礙有關[7-8]。氟啶胺在哺乳動物細胞中是一種有效的線粒體解偶聯試劑，其原理主要是通過氟啶胺分子上氨基的質子化和去質子化[1]。氟啶胺對細胞中的能量產生具有特異性抑制作用，該殺菌劑能夠抑制細胞內的氧化磷酸化過程[9]。有研究者提出，氟啶胺能夠通過作用于線粒體呼吸傳遞鏈中的復合酶I引起活性氧物種(ROS)的過量產生，從而導致多巴胺神經細胞的死亡[10]。細胞器線粒體是細胞中產生能量的主要場所，而能量產生不足很可能導致生物體發生神經褪變性疾病和運動功能障礙[11]。因此，研究氟啶胺對線粒體和多巴胺系統的毒性效應對于探究氟啶胺的毒性作用機制具有關鍵性作用。

斑馬魚是用于研究人類疾病和篩選化學品的有效脊椎動物模型[11-12]。由于氟啶胺是典型的線粒體解偶聯試劑，因此我們測定了氟啶胺對胚胎線粒體氧氣消耗速率的影響。與此同時，生物體內線粒體功能異常往往使多巴胺系統發生改變，因此我們測定了氟啶胺對胚胎中與多巴胺信號傳導有關基因的轉錄水平。本文的目標是研究氟啶胺對斑馬魚胚胎線粒體呼吸速率和多巴胺神經信號傳導的不利影響。

1 材料與方法(Methods and materials)

1.1 實驗材料

成年野生型斑馬魚(Danio rerio)來源于美國佛羅里達大學動物保護中心。殺菌劑氟啶胺(79622-59-6)、二甲基亞砜、寡霉素、羰基-氰-對-三氟甲氧基苯肼(FCCP)和疊氮化鈉均為分析純化學試劑，購自美國西格瑪奧德里奇化學制品有限公司；海馬生物能量測定儀XFe24購自美國海馬生物科技有限公司；TRIzol試劑購自美國生命技術有限公司；2100生物分析儀購自美國安捷倫科技有限公司；RNA純化試劑盒購自德國快而精有限公司；量子熒光定量儀Qubit?2.0購自美國賽默科技有限公司；T100TM熱循環儀購自美國生命科學有限公司；CFX實時定量PCR檢測系統購自美國伯樂公司。

1.2 動物暴露實驗

根據Westerfield[13]中斑馬魚飼養方法，成年野生型斑馬魚的生活水溫維持在26 ℃，保持每日光照14 h；根據Kimmel[8]所述方法進行斑馬魚胚胎的收集。暴露實驗前，將氟啶胺溶于DMSO中配制成儲備液，并稀釋至各測試溶液(0.01% DMSO)。本文中，使用產卵后6 h的斑馬魚胚胎進行實驗，分別暴露于含0～1.0 μmol·L-1氟啶胺溶液中，各溶液中加入10只胚胎，設定3個平行，經96 h暴露后，觀察各溶液中胚胎的存活和畸形情況，計算氟啶胺對斑馬魚胚胎的96 h半數致死濃度，半數致死濃度是指受試生物半數死亡時的毒物劑量，本文通過應用Logistic模型擬合氟啶胺對斑馬魚胚胎的劑量效應關系來確定LC50值。

獲得氟啶胺對斑馬魚胚胎的LC50值后，將產卵后6 h的斑馬魚胚胎分別在對照組溶液(0.01% DMSO)和實驗組溶液(LC50= 0.5 μmol·L-1氟啶胺)中暴露24 h，各濃度添加50只胚胎，平均分為5組，最終各組取10只胚胎進行線粒體呼吸耗氧速率的測定(N = 10)。

將產卵6 h的斑馬魚胚胎分別在對照組溶液(0.01% DMSO)和實驗組溶液(LC50=0.5 μmol·L-1氟啶胺)中暴露96 h，各濃度添加120只胚胎，平均分為6組，收集各組存活胚胎為一個樣品，將這些樣品儲存于-80 ℃冰箱中，以待后續基因轉錄水平的測定(N = 6)。

1.3 線粒體呼吸作用

斑馬魚胚胎經過24 h暴露后用于評價其線粒體呼吸速率。應用海馬生物能量測定儀檢測斑馬魚胚胎的線粒體氧氣消耗速率。首先，在對照組和實驗組中各挑選10只斑馬魚胚胎轉移至24孔板各微室內，其余4個微室用于背景值測定。在實驗中將以下試劑依次注入各微室內，改變線粒體呼吸狀態：寡霉素、羰基-氰-對-三氟甲氧基苯肼(FCCP)和疊氮化鈉的測試結果如圖1所示[14]。起初，儀器對斑馬魚胚胎的基礎呼吸速率檢測10次；然后，向微室內注入寡霉素抑制ATP合成，此時斑馬魚氧氣消耗速率的減少量可表示ATP產量，基礎呼吸速率和ATP產量的差值為質子漏，該過程中儀器對斑馬魚的耗氧速率檢測18次；其次，向微室內注入FCCP使胚胎達到最高呼吸速率，其高出基礎呼吸速率的部分稱為儲備能量，該過程中儀器對斑馬魚的耗氧速率檢測8次；最后，向微室內注入疊氮化鈉抑制線粒體呼吸，剩余氧氣消耗速率指非線粒體呼吸部分，該過程中儀器對斑馬魚的耗氧速率檢測24次。

1.4 RNA提取和RT-QPCR檢測

對照組和實驗組的斑馬魚胚胎經96 h暴露后用于基因轉錄情況的檢測。首先向各樣品中加入TRIzol試劑對生物體內的RNA進行提取，然后使用2100生物分析儀檢測RNA的完整性，其次使用RNA純化試劑盒對RNA進行提純，再次使用量子熒光定量儀檢測RNA的濃度，最后各樣品使用相同質量的RNA反轉錄形成DNA。

應用CFX實時定量PCR檢測系統對各樣品中的DNA進行熒光染色并定量擴增。熱循環參數參照Wang等[14]中方法。我們檢測了3個管家基因的轉錄水平，它們分別為核糖體亞基18 (rps18)，肌動蛋白(β-actin)和核糖體蛋白L13α (rpl13α)，用于使目標基因的轉錄水平標準化，CFX管理軟件給出這些管家基因的綜合M值為0.98 (CV = 0.34)。表1為本文所檢測基因的引物列表，其中包括鋅銅超氧化物歧化酶(sod1)，錳超氧化物歧化酶(sod2)，過氧化氫酶(cat)，酪氨酸羥化酶(th)，多巴胺運載體(dat)以及多巴胺受體(drd1, drd2a, drd2b, drd3, drd4a, drd4b, drd4c, drd7)。

1.5 統計分析

本文應用第六版GraphPad Prism對線粒體呼吸氧氣消耗速率和多巴胺系統相關基因轉錄水平的數據進行統計分析，我們將數據表示為平均值±標準誤差。我們應用t檢驗中曼-惠特尼檢驗方法檢測對照組樣品與實驗組樣品的線粒體呼吸氧氣消耗速率、抗氧化系統相關基因轉錄水平和多巴胺系統相關基因轉錄水平是否具有顯著性差異，P值設為0.05。這種方法假設2個樣本分別來自除了總體均值以外完全相同的2個總體，目的是檢驗這2個總體的均值是否有顯著的差別。曼-惠特尼檢驗方法可以看作是對兩均值之差參數檢驗方式的T檢驗。這種方法適用于數據總體分布類型未知，或數據總體分布類型已知，但并非正態分布的數據類型，生物數據往往具有這種特點，因此本文選擇該方法進行統計分析。

圖1 海馬生物能量測定儀線粒體呼吸氧氣消耗速率測試總描述圖Fig. 1 Seahorse diagram depicting profile of oxygen consumption rate throughout the assay

符號Symbol基因名稱Gene name正向引物(5’ to 3’)Forward primer (5’ to 3’)反向引物(5’ to 3’)Reverse primer (5’ to 3’)NCBI檢索號#NCBI accession管家基因 Housekeeping genesaβ-actin肌動蛋白 beta-actinCGAGCAGGAGATGGGAACCCAACGGAAACGCTCATTGCAF057040arps18核糖體亞基18Ribosomal subunit 18TCGCTAGTTGGCATCGTTTATGCGGAGGTTCGAAGACGATCABX296557brpl13核糖體蛋白L13Ribosomal protein L13AGCTCAAGATGGCAACACAGAAGTTCTTCTCGTCCTCCNM_212784抗氧化系統基因 Antioxidant system genescsod1銅鋅超氧化物歧化酶Cu/Zn superoxide dismutaseCGTCTATTTCAATCAAGAGGGTGGATGCAGCCGTTTGTGTTGTCNM_131294.1csod2錳超氧化物歧化酶Mn superoxide dismutase CTTGGGATAGATGTCTGGGGTGGTCTGATTAATTGTGCGAY195857.1dcat過氧化氫酶 CatalaseAACCAACAACCCTCCAGACAGTCCGCTCTCGGTCAAAATGGNM_130912.2多巴胺系統基因 Dopaminergic system geneseth酪氨酸羥化酶Tyrosine hydroxylaseGACGGAAGATGATCGGAGACACCGCCATGTTCCGATTTCTNM_131149.1fdat多巴胺運載體Dopamine active transporterAGACATCTGGGAAGGTGGTGACCTGAGCATCATACAGGCGNM_131755.1fdrd1多巴胺受體d1Dopamine receptor d1ACGCTGTCCATCCTTATCTCTGTCCGATTAAGGCTGGAGNM_001135976.2fdrd2a多巴胺受體d2aDopamine receptor d2aTGGTACTCCGGAAAAGACGATCGGGATGGGTGCATTTCNM_183068.1fdrd2b多巴胺受體d2bDopamine receptor d2bCGTGCCCTTCATTATCACCTAGCGAGGATGCCAGTTTTTNM_197936.1fdrd3多巴胺受體d3Dopamine receptor d3ATCAGTATCGACAGGTATACAGCCCAAACAGTAGAGGGCAGGNM_183067.1edrd4a多巴胺受體d4aDopamine receptor d4aGCCTCTTTCCCATCTCACAGCTCAGACACACCAGCACGTTNM_001012616.3fdrd4b多巴胺受體d4bDopamine receptor d4bGCAAGGGAGAAGGTGGTGTAGTGGTCATGGGGTCACTCTCNM_001012620.2fdrd4c多巴胺受體d4cDopamine receptor d4cAGACCCCAGTGAATGCAAACAGTTTGGCTTTGCGTGTTTCNM_001012618.1fdrd7多巴胺受體d7Dopamine receptor d7GATAACCCGCTCCACGACTCTTCACAGAAGCTCCCGAACNM_001113643.1

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2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 氟啶胺對斑馬魚胚胎的96 h半數致死濃度

為了獲取氟啶胺對斑馬魚胚胎的96 h半數致死濃度LC50值，使用產卵6 h的斑馬魚胚胎置于0.01% DMSO溶液中作為對照組，實驗組氟啶胺暴露濃度范圍為0.1～1 μmol·L-1。結果表明，經96 h暴露后斑馬魚胚胎的死亡率隨著濃度的增加而增加，如圖2所示。0.1～0.3 μmol·L-1氟啶胺對斑馬魚胚胎具有輕微毒性，0.8～1 μmol·L-1氟啶胺會造成斑馬魚胚胎幾乎100%死亡。經計算表明氟啶胺對斑馬魚胚胎的96 h半數致死濃度LC50值為0.5 μmol·L-1，該濃度導致斑馬魚表現出嚴重的卵黃囊水腫、心包水腫以及中軸骨骼發育異常等形態學變化，如圖3所示。

圖2 斑馬魚胚胎經96 h暴露死亡率隨氟啶胺濃度增加的變化曲線Fig. 2 The mortality of zebrafish embryos exposed to different doses of fluazinam after 96 h

圖3 LC50濃度氟啶胺導致斑馬魚胚胎形態發育異常Fig. 3 Fluazinam of LC50 level induced morphological abnormality in zebrafish embryos

盡管斑馬魚胚胎外側的絨毛膜對胚胎具有一定保護作用，但氟啶胺對斑馬魚胚胎仍具有相當高的毒性，96 h半數致死濃度LC50為0.5 μmol·L-1。此外，該殺菌劑極易在魚體內富集，有研究者發現，氟啶胺在藍鰓太陽魚體內生物富集因子BCF值的范圍高達720～960[15]。氟啶胺的高疏水性決定該殺菌劑極易被生物體吸收，且其線粒體解偶聯活性決定該殺菌劑易對線粒體呼吸產生反應性活性。有關報道表明，氟啶胺能夠引起哺乳動物在形態上的發育缺陷，如大鼠或兔子的骨骼發育不良[16]。本文中，氟啶胺同樣能夠引起斑馬魚胚胎的形態發育異常，其中中軸骨骼發育異常和心臟水腫是最為常見的發育缺陷。由于導致生物體形態發育異常的原因較多且復雜，化學品在一個生物體系中往往具有多重復雜的作用機制。其中一個可能的原因是，線粒體功能異常導致魚類生長發育和心血管功能異常，且有研究者發現，線粒體內ATP產量減少能夠導致魚類在發育過程中原腸胚的形成受到嚴重阻礙[17]。另外一個可能的原因是多巴胺神經傳導異常在一定程度上能夠導致斑馬魚形態發育異常[18]。

2.2 LC50濃度氟啶胺改變線粒體呼吸耗氧速率和抗氧化系統相關基因的轉錄水平

圖4展示了斑馬魚胚胎經過24 h暴露后不同來源線粒體及非線粒體呼吸耗氧速率的總描述圖。LC50濃度的氟啶胺能夠顯著地抑制胚胎的基礎呼吸速率(P = 0.0317)和ATP合成(P = 0.0456)。在線粒體呼吸過程中，氫離子在復合酶的作用下由基質轉移至膜間隙，大量氫離子再通過ATP合成酶從膜間隙轉移到基質中消耗氧氣并推動ATP形成，寡霉素能夠抑制ATP合成酶，從而導致氫離子無法通過ATP合成酶進入基質中，此時耗氧速率的減少量能夠表示ATP合成量。但少量氫離子通過直接跨膜進入基質中消耗氧氣，該部分耗氧速率能夠衡量質子漏量。FCCP是一種解偶聯試劑，能夠高度改變膜通透性，使大量氫離子直接跨膜進入基質中，此時ATP無法合成，但線粒體耗氧速率達到最高值，其高出基礎呼吸速率的部分表示儲備能量，最高呼吸速率和儲備能量能夠反映生物體對外界刺激做出響應的能力。最后，疊氮化鈉能夠完全抑制線粒體呼吸，剩余耗氧速率可表示非線粒體呼吸速率。本文中，氟啶胺對最高呼吸速率、儲備能量、質子漏和非線粒體呼吸未發生顯著性效應，如圖4所示。

圖4 線粒體各來源呼吸耗氧速率統計分析圖注： *表示實驗組與對照組具有顯著性差異。Fig. 4 Oxygen consumption rate of different mitochondrial respiratory sourcesNote: * indicate a significance of difference between the treatment and the control at P < 0.05.

圖5 抗氧化系統相關基因的轉錄水平注：*表示實驗組與對照組具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 5 The transcript levels of genes related to anti-oxidative systemNote: * indicate a significance of difference between the treatment and the control at P < 0.05.

圖6 多巴胺系統相關基因的轉錄水平注： *表示實驗組與對照組具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 6 The transcript levels of genes related to dopamine systemNote: * indicate a significance of difference between the treatment and the control at P < 0.05.

細胞的能量內穩態對魚類的發育十分重要。有研究者發現，線粒體功能紊亂能夠引起斑馬魚的發育異常[17]。本文中，斑馬魚的線粒體生物能量穩態嚴重受到了LC50濃度氟啶胺的干擾，這主要體現在胚胎的基礎呼吸速率和ATP產生量顯著降低。氟啶胺是哺乳動物細胞內一種典型的線粒體解偶聯試劑，該殺菌劑能夠引起線粒體質子漏和ATP減產[18]。本實驗結果表明氟啶胺也能引起魚類細胞線粒體內氧化和磷酸化的解偶聯。有研究報道，氟啶胺能夠通過作用于線粒體電子傳遞鏈上的復合酶I，從而導致人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞內的氧化還原狀態失衡[10]。因此，氟啶胺對斑馬魚胚胎的線粒體呼吸作用具有一定毒性效應。

線粒體是生物體內產生氧化自由基的主要場所，因此線粒體功能異常將會激發生物體內的抗氧化系統[14]。在本文中，我們檢測了胚胎的抗氧化系統相關基因的轉錄水平。結果表明，LC50濃度氟啶胺對sod1和cat的轉錄水平未產生顯著性影響，但是對sod2的轉錄水平產生顯著性影響，LC50濃度氟啶胺能夠顯著地促進sod2的轉錄(P = 0.0006)，如圖5所示。Sod2是在線粒體內發揮抗氧化作用的一種抗氧化酶，而sod1是在線粒體外發揮抗氧化作用的一種抗氧化酶[19]。我們的轉錄數據說明LC50濃度氟啶胺引發了線粒體內氧化自由基的產生，從而引發了線粒體功能異常。

2.3 LC50濃度氟啶胺干擾多巴胺通路關鍵基因的轉錄水平

為了檢測氟啶胺對斑馬魚胚胎多巴胺神經系統的干擾效應，我們檢測了與多巴胺神經通路相關基因的轉錄水平。結果表明，LC50濃度氟啶胺對斑馬魚胚胎的多巴胺神經通路具有顯著的干擾效應。酪氨酸羥化酶(TH)在多巴胺合成中具有重要作用，LC50濃度氟啶胺導致胚胎內th的轉錄水平顯著降低(P = 0.0041)。多巴胺運載體(DAT)能夠回收突觸間隙中過量的多巴胺，并終止多巴胺信號傳導，多巴胺運載體dat的轉錄水平未顯著受到LC50濃度氟啶胺的調控。另外，多巴胺受體(DRD)也是多巴胺通路的重要組成部分，本文檢測了胚胎體內8個多巴胺受體drd的轉錄水平，其中唯一一個多巴胺受體drd2a的轉錄水平發生顯著性變化(P = 0.0006)。本文多巴胺通路相關基因轉錄水平的統計分析結果見圖6。

細胞內ROS過量積累能夠干擾生物體多巴胺信號傳導，細胞內線粒體功能異常也與生物體多巴胺神經細胞死亡有一定關系[20]。有研究報導，氟啶胺能夠導致人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞死亡[10]，但目前沒有研究者報導氟啶胺對完整生物體多巴胺神經通路的干擾效應。為了檢測多巴胺信號傳導紊亂在氟啶胺引發神經毒性中的作用，我們檢測了酪氨酸羥化酶、多巴胺運載體和多巴胺受體的基因轉錄水平。氟啶胺暴露導致斑馬魚多巴胺系統中的酪氨酸羥化酶基因th和多巴胺受體基因drd2a的轉錄水平降低。這說明生物體內多巴胺系統是氟啶胺引發神經疾病的有效靶位。暴露于其他農用化學品也能夠增加動物體內多巴胺神經元褪變的風險，如聯吡啶類除草劑、有機氯類殺蟲劑以及二硫代氨基甲酸鹽類殺菌等等[21]。

本文測定了典型殺菌劑氟啶胺對斑馬魚胚胎的96 h半數致死濃度LC50值，并研究了該濃度下氟啶胺對斑馬魚胚胎體內線粒體呼吸耗氧速率和多巴胺神經通路有關基因轉錄水平的干擾效應。結果表明，LC50濃度氟啶胺能夠顯著地抑制斑馬魚的基礎呼吸速率和ATP合成速率，這是因為氟啶胺是一種解偶聯試劑，它能夠改變線粒體內膜對質子的通透性，從而干擾線粒體氧化呼吸作用。LC50濃度氟啶胺還能夠激發線粒體內sod2的轉錄水平增加，這說明氟啶胺引發的線粒體內氧化自由基生成也會導致線粒體功能異常。另外，LC50濃度氟啶胺能夠干擾斑馬魚胚胎的多巴胺信號傳導，從而使多巴胺的合成和接收受到阻礙。氟啶胺對斑馬魚胚胎具有極高的毒性效應，該殺菌劑在水環境中的殘留仍然是備受關注的環境問題。