3種新型污染物對發光菌的毒性作用研究

汪皓琦, 董玉瑛, 汪靈偉

大連民族大學環境與資源學院，大連 116605

新型污染物是一種以低微濃度就能影響生物生存或抑制生物機能的化學物質，這類污染物來源廣、排放量大，造成其在環境中長期存在。隨著新型污染物的大量使用，收納水體已檢出它們的活性成分，且檢出濃度有逐年增大的趨勢。其環境殘留可對土壤微生物、水生生物、植物生長發育等方面產生明顯的危害或潛在的負面影響[1-3]。環境中典型的新型污染物包括藥品及個人護理品、內分泌干擾物、有機氯農藥等，選取其代表作為研究對象(三氯生、五氯酚、雙酚A)探究其對發光菌的毒性作用。三氯生是一種廣泛使用的抗菌劑和殺菌劑，主要添加于各種護理品等各類消費產品中。在各種環境介質和生物體內都檢測到其存在，因其具有親脂性、持久性、生物累積性和毒性，故對生態環境和人類健康造成了潛在危害[4]。五氯酚是一種常見的易電離、難溶于水的氯代芳香族有機污染物。自20世紀30年代以來，五氯酚及其鈉鹽在全球范圍內被廣泛用作殺菌劑、除草劑、殺蟲劑和木材防腐劑[5]。雙酚A會擾亂人體內的代謝過程，被認定具有雌激素活性的化學品。工業上常被用來合成聚碳酸酯、環氧樹脂等材料。隨著塑料制品行業的迅猛發展以及塑料制品的廣泛使用，大量消耗的雙酚A進入環境可造成嚴重的環境污染[6]。

新型有機污染物在環境中有低劑量混合以及持久性存在的特點，其產生的聯合毒性對生物產生了潛在的風險。單一污染物的生物學效應顯然不能滿足現實中水體的特點，進行聯合毒性的研究迫在眉睫。國際上關于新型污染物的研究主要集中于其在環境中的遷移轉化，對其毒性作用的研究文獻較少，國內的研究尚屬剛剛起步。因此研究新型污染物的生態毒性機理以及其他環境污染物的聯合毒性效應值得重視[7-9]。

結合生物發光細菌應用范圍廣、使用簡便、靈敏度高、相關性好、反應速度快等優點，本實驗將發光菌(Photobacterium phosphoreum)作為指示物，通過測定發光菌的發光強度，計算發光抑制率，并對濃度 和發光抑制率作圖，確定3種新型污染物單獨作用時的半數效應濃度(EC50)和混合體系中混合物的EC50。進一步采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)、混合毒性指數法(MTI)等聯合毒性評價方法對聯合毒性作用類型進行評價，判斷其聯合作用機制，并結合發光菌的發光原理，對聯合毒性作用機理進行初步討論。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與材料

DXY22型生物毒性測試儀(中國科學院南京土壤研究所制造)；8522型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；THZ282型氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇儀器廠)；DHP29082型電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)；LDZX240CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；不同量程的精密移液器(Thermo公司)；SJH型潔凈工作臺(沈陽市凈化儀器廠二分廠)。

1.2 試劑材料

1.2.1 主要試劑

雙酚A、三氯生、五氯酚皆為國藥集體化學有限公司提供，純度>99%，其他實驗試劑皆為國產分析純。

1.2.2 菌種的培養

工作菌液的制備：吸取一定量培養好的搖瓶菌液于3%NaCl溶液中，充分攪拌，稀釋程度以控制空白(由2 mL的3%NaCl溶液和0.1 mL的工作菌液組成)發光強度在300～800為宜。明亮發光桿菌(Photobacterium phosphoreum)凍干粉購自中國科學院南京土壤研究所微生物室。有關發光菌凍干粉的復蘇、斜面菌種的培養、搖瓶菌液的培養、工作菌液的制備等操作方法見文獻[10]。

1.3 急性毒性EC50的測定

發光細菌毒性測試經毒性預試驗、單一和聯合毒性分析等步驟實施實驗設計[10]。

1.3.1 預實驗

選定濃度梯度進行試驗，觀察15 min發光菌的發光抑制率，找出試驗的正確濃度范圍。

1.3.2 單一毒性EC50的測定

在預實驗的基礎上，將待測化合物配成適當的6個濃度梯度，各取不同梯度的溶液2 mL加入具塞磨口比色管(Φ15 cm，高6 cm)中，以2 mL 3%NaCl溶液作空白對照，取0.2 mL工作菌液于各比色管中，加塞上下振蕩均勻，去塞，暴露15 min，測定發光強度。每個濃度梯度設3組平行，保證標準偏差低于10%。

1.3.3 聯合毒性EC50的測定

根據單一毒性的測試結果，繪制每種醫藥品對發光菌作用的效應-劑量曲線，以獲得單一毒性EC50，并將待測物三氯生、雙酚A、五氯酚按等毒性比例配制二元及多元混合體系，每組濃度設置3個平行，以3%NaCl為空白對照，根據預實驗結果設6個濃度梯度(半數抑制率附近)，測定混合體系對發光菌的聯合毒性EC50值。確保3組平行實驗的標準偏差低于10%。

1.4 數據處理

鑒于污染物濃度與其對應發光抑制率的關系在EC50附近呈良好的線性分布，故本實驗采用Excel繪圖，將化合物濃度(x)和發光抑制率(y)進行回歸分析，求得回歸方程：y(發光抑制率)=ax(化合物濃度)+b。根據線性方程求出發光抑制率為50%時所對應的化合物濃度，即為化合物單獨作用時EC50。化合物濃度和死亡率之間的相關系數r，經顯著水平檢驗，置信區間范圍大于95%。

1.5 聯合毒性評價方法

多種污染物與生物體的聯合毒性作用，可以分為獨立、相加、協同和拮抗4種作用類型，采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)、混合毒性指數法(MTI)等方法可對這些類型進行定量判別和分析[11-12]。表1為聯合毒性作用類型量化評價依據。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 單一毒性作用測試分析

綜合分析3種新型污染物(三氯生、雙酚A、五氯酚)對發光細菌的急性毒性測試結果可以看出(表2)，隨著新型污染物濃度的升高，發光菌的發光強度呈下降趨勢，且污染物濃度和死亡率之間的相關系數r均大于0.95。相對發光強度與3種新型污染物在一定的濃度范圍內具有良好的線性關系。

3種新型污染物對發光菌有不同程度的抑制作用，對發光菌的半數效應濃度(EC50)值分別為：0.045、0.74、0.037 mg·L-1，其毒性作用強弱為：五氯酚﹥三氯生﹥雙酚A，即五氯酚的生物毒性最大，以下依次是三氯生、雙酚A。3種新型污染物的分子結構如圖1，從結構上看，3種污染物母環相同，各自的取代基的種類和數量皆不同，即母體相同的化合物，不同的取代官能團對其毒性效應影響較顯著。翟麗華[13]選取17個部分取代苯化合物對發光菌進行急性毒性研究，得到取代基對發光菌的毒性貢獻大小順序為：-NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。這與本研究結果一致，可推斷3種新型污染物抑制發光菌的差別，來源于不同取代基影響作用于微生物靶點的效應程度。若獲得各取代基對發光菌的毒性貢獻，則需要進一步分子相互作用機制的相關理論和研究支持。

2.2 二元及三元混合體系的聯合毒性評價

二元及三元混合體系的EC50值和聯合毒性評價結果見表2。混合體系中多個EC50值，分別與表格左側污染物順序相對應。等毒性比例混合下，三氯生+雙酚A、三氯生+五氯酚、雙酚A+五氯酚3組二元混合體系的M值均大于M0值；AI均小于0；MTI均小于0。因此，3組二元混合體系均表現出拮抗作用。AI值越接近于0，越靠近相加作用，而MTI值越接近于0，越靠近獨立作用，根據3組二元混合體系的MTI和AI值大小的不同，可判斷其拮抗作用的強度有所不同，由此獲得不同體系拮抗作用的排序為：雙酚A+五氯酚﹥三氯生+五氯酚﹥三氯生+雙酚A。

表1 不同評價指數的聯合作用類型判斷標準Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

表2 3種新型污染物單一毒性測試結果Table 2 Single toxicity test results of three emerging pollutants

圖1 3種新型污染物結構式Fig. 1 Structural formula of three emerging pollutants

等毒性比例混合下，三元混合體系的M值大于M0值；AI小于0；MTI小于0。三元聯合毒性作用表現為拮抗效應。由于二元混合體系聯合毒性均表現為拮抗作用，由此猜測3種新型污染物分子間的相互作用可導致體系聯合毒性降低，多個二元拮抗體系累加，各分子間相互作用增強可導致多元混合體系呈現拮抗作用。因此，多元混合體系聯合作用類型在多數情況下呈現為拮抗作用。實驗結果與假設相符，證實猜測：多元混合體系聯合毒性表現為拮抗的原因是多種拮抗體系累加的結果。方章順等[14]研究典型抗生素與群體感應抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯合毒性，證明了兩元混合體系的拮抗作用是三元體系為拮抗作用的根本原因。任皓等[15]在鹽酸吉他霉素與金霉素、鹽霉素、黃霉素對發光細菌聯合毒性作用實驗的研究結果中發現：在多個混合體中，拮抗作用表現較強的分子混合體系起主導作用。由此可見，污染物在環境中經過各途徑混合后，其相互作用可能導致毒性減弱。

在現實環境的污染評價中，不能將各污染物毒性通過簡單疊加來判斷其綜合毒性[16]。實驗獲得聯合毒性類型為拮抗作用，與前人研究結果相一致。叢永平等[17]研究發現，四環素類抗生素和氯霉素類抗生素對發光菌(Photobacterium phosphoreum)的聯合急性毒性亦均表現出拮抗作用。翟麗華[13]選取5種有機化合物苯、苯酚、苯胺、硝基苯、對氯酚采用等比毒性進行聯合毒性研究,其中聯合作用類型以拮抗為主，上述研究同時表明，拮抗作用在同類化合物發生的概率較高。

表3 二元和三元混合體系的 EC50 值和聯合毒性評價參數及作用類型Table 3 Joint toxicity evaluating parameters and types for different binary and ternary systems

2.3 聯合毒性機制初步討論

綜合分析二元、三元混合體系聯合毒性，同為拮抗效應，對于呈現的聯合作用效應，可從3種新型污染物不同取代基的特性及其相互作用、發光菌發光原理進行初步的聯合毒性機理分析。大部分發光細菌發光機制是基本相同的，都必須有細菌熒光素酶(LE)、還原性的黃素單核苷酸(FMNH2)、氧氣(O2)、長鏈脂肪醛(RCHO)的參與，大體發光反應過程如下[17-19]：

FMNH2+O2+RCHO→FMN+PRCOOH+H2O+光(light)

此反應中，黃素單核苷酸是重要的輔酶，它的還原形式(FMNH2)與氧化形式(FMN)之間的轉化起到了傳遞氫的作用。研究的化合物可與FMNH2分子以氫鍵結合，阻礙了FMNH2對氫的傳遞作用，從而干擾了正常的發光反應，致使發光菌的發光受到抑制。

結合本實驗3種新型污染物的聯合毒性作用類型，拮抗作用可由競爭位點理論來解釋[20]。3種新型污染物均屬于芳香族化合物，假設這類物質進入機體后首先形成離子活性形式，然后與生物大分子的電荷中心發生結合。以三元混合體系的聯合作用為例，當五氯酚和三氯生與雙酚A共同作用時，由于雙酚A在等毒性溶液中的物質濃度較高，且分子量小，更容易進入細胞膜，大量雙酚A活性離子占據有限結合位點，從而降低了五氯酚和三氯生活性離子的結合機會，而雙酚A的毒性遠小于五氯酚和三氯生，導致混合毒性降低，聯合毒性作用表現為拮抗作用。

新型污染物混合體系對發光菌的聯合作用呈現以拮抗作用為主，表明此類污染物環境殘留可導致相關化學品功效降低，引發微生物耐藥性的產生和傳播的風險。若進一步分析引起拮抗作用的原因，還需要對毒物聯合作用機制以及對發光菌生理生化反應等進行深入研究，實現對混合毒性和作用機制的定量預測，為該類污染物全生命周期影響評價奠定基礎。