生物納米孔分析技術研究進展

任明偉

摘 要 本文從生物納米孔的%Z-HL納米孔、Aerolysin納米孔、MspA納米孔、噬菌體phi29連接器的四種分類出發，對生物納米孔分析技術的應用與發展進行了分析，納米孔分析技術的發展，特別是近年來在DNA測序得到了廣泛應用。

關鍵詞 生物納米孔 DNA測序

中圖分類號：Q819 文獻標識碼：A

0前言

納米孔技術作為低成本、高效率的DNA檢測技術，研究已經取得了巨大進步。本文著重介紹分子生物學技術的組合，以及納米孔技術的新進展。

1生物納米孔的種類

1.1 %Z-HL納米孔

%Z-HL生物通道蛋白被用于構建了第一個納米孔，也是目前應用最為廣泛的生物納米孔。%Z-HL是金黃色葡萄球菌分泌的一種多肽毒素，含有293個氨基酸，相對分子質量為3.32？04，可通過自組裝形成七聚體的跨膜通道，這一蘑菇狀的納米通道由一個較大的膜外前庭和一個%[-桶狀結構的跨膜莖部組成。%Z-HL優異的性質使其成為目前應用最為廣泛的生物納米通道：首先，%Z-HL易于自組裝和結構穩定，電導均勻，使得分析物產生的阻斷事件可重復；第二，%Z-HL對分析物本質上是非選擇性的，確保電流阻斷事件是由要測量的各個分子的體積效應引起的。第三，%Z-HL腔對基因突變或化學修飾敏感，以實現特異性檢測。

1.2 Aerolysin納米孔

Aerolysin是一種從嗜水氣單胞菌中提取的%[-致孔菌，是一種革蘭氏陰性桿菌，與人體腹瀉和深部傷口有關。成熟的Aerolysin可以與真核細胞膜表面的糖蛋白受體相互作用。合并并插入細胞膜形成孔，改變膜通透性并最終導致細胞死亡。Aerolysin單體在水溶液中自發形成具有蘑菇形狀的七聚體結構，寬約15nm，高約7.0nm，孔徑為1.0至1.7nm。其形狀和存在廣泛用于納米孔技術的%Z-HL類似，但在順式末端沒有前庭結構。

1.3 MspA納米孔

MspA是恥垢分枝桿菌恥垢分枝桿菌外膜的主要組分。MspA納米孔是由相對分子質量為2.0？04的MspA單體蛋白構成的同型八聚體，類似于在最窄點處直徑約1.2nm且長度約0.5nm的煙囪。這是一個很好的納米孔檢測傳感器。

1.4噬菌體phi29連接器

噬菌體phi29連接器主要由12個gp10亞基組成，形成～7.0nm通道，直徑3.6nm，開放端寬6.0nm。在高鹽強酸堿環境（pH=2.0-12）下，噬菌體phi29連接器通道仍能保持穩定的通道特性。目前，關于噬菌體phi29連接器研究最多的是一種6-packRNA（pRNA）和ATPase蛋白gp16，它們組裝成噬菌體phi29包裝馬達，作為復雜的納米孔研究。由于通道的直徑較大，可以實現較大的生物分子如dsDNA和高分子量聚合物的檢測。

2生物納米孔分析技術的應用與發展

迄今為止，DNA是納米孔研究中最常見的聚合物，脂質嵌入的離子通道檢測DNA是該研究的突破性實例。最近，固態納米孔已被用于檢測核小體結構和RNA聚合酶的差異，催化DNA轉錄的關鍵部分，為理解染色體結構和轉錄研究創造了新的機會。一些蛋白質在運輸過程中“減壓”，運輸過程可用于測量減壓動力學。已經研究了許多這些蛋白質的減壓行為，并且納米孔可以被動態地用作不需要標記的高效力光譜儀。為了研究大腦對藥物的化學反應，重要的神經遞質也被動態地實時區分開來。與其檢測技術相比，納米孔更有前途，效率高，速度快，價格低廉，且具有良好的準確性和檢測性能。

2.1大型固態納米孔可以用來動態地捕獲釋放的細菌

為動態捕獲單個單元提供更快，更便宜的方法。使用脂肽涂覆的固態納米孔，可以檢測到DNA與相鄰孔隙膜的相互作用。熱反應性聚合物的發展促進了智能納米孔的發展。智能納米孔可以用作動態響應溫度的裝置，由電解質刷組成的生物納米孔可以控制孔附近的鹽電導。

納米孔的DNA測序也已取得進展。最近的分子動力學研究表明，使用DNA聚合酶作為棘輪，通過控制DNA單鏈在石墨烯納米孔上的轉運可以獲得核苷酸序列的高精度讀數。在溶血素中使用鏈霉抗生物素蛋白可以選擇性地固定DNA鏈，這可以高分辨率地區分孔上不同幾何位置的核酸。P-n半導體結降低了DNA易位速率，可以在位移過程中動態控制電壓。采用新型基于CMSO的放大器，可以實現亞微秒級的電流檢測。關于DNA測序的理論研究，已經提出了可行的建議和方法來解決上述對離子電流測量速度的限制。模擬顯示石墨烯碳納米帶上的納米孔可以使用孔邊緣處的電流密度，導致更高的分辨率。也已經提出了垂直于納米通道放置的石墨烯碳納米帶的電導變化作為DNA堿基易位測序裝置。

2.2有機小分子檢測

生物納米孔在直接檢測小有機分子方面有一些困難。如果分子適配器可以引入到納米孔中，則適配器和分析物之間的特定相互作用可以用于檢測小的有機分子。適配器通常是一個圓形分子，它在納米孔內以非共價方式連接到孔壁，并充當納米孔和小分子之間相互作用的介質。

3結束語

生物納米孔分析技術已廣泛應用于DNA測序、蛋白質結構研究及單分子檢測等領域，且應用領域正在不斷拓寬。然而，作為一種新穎的單分子分析手段，納米孔技術在實際樣品檢測、數據處理和檢測裝置等方面也存在著諸多挑戰。

參考文獻

[1] Kasianowicz，J.J.&E.Brandin;&D.Branton;，etal.CharacterizationofIndividualPolynucleotideMoleculesUsingaChannel[J].ProcNatlAcadSciUSA，2016，93（24）：13770-13773.