糖皮質激素對胰腺癌細胞增殖、黏附、遷移、侵襲生物學行為的影響

蘇杰 盧建 黃高翔 胡新根 姜春婷 張寶燕

糖皮質激素（glucocorticoids，GCs）是體內重要的神經內分泌激素，在軀體和心理應激時均明顯升高。GCs主要通過糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的介導發揮生物學效應，包括免疫抑制、抗炎、維持內環境穩定、胚胎發育和創傷修復等[1-2]。近年來研究發現GCs還參與腫瘤的發生、發展，地塞米松是人工合成的GCs，不僅可以作為化療方案的組成藥物直接抑制某些血液系統腫瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡；還可以作為實體腫瘤化療的重要輔助藥物，治療與實體腫瘤相關的某些合并癥及腫瘤治療相關不良反應。胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，90%以上是起源于腺管上皮的胰腺導管腺癌[3]。其診斷和治療均十分困難，發現時大多已經轉移，病死率非常高，5年生存率不足5%，中位生存期僅2～3個月，據美國國立衛生研究院報道其死亡率高

居惡性腫瘤第4位[4]。目前有關神經內分泌激素，尤其是GCs對胰腺癌增殖、黏附、遷移和侵襲等生物學行為的影響了解不多，僅有的研究局限在GCs抑制胰腺癌細胞增殖和增強化療藥物作用下腫瘤細胞存活等方面[5-6]。因此，闡明地塞米松對胰腺癌細胞生物學行為的影響具有重要的理論及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 細胞株 小鼠胰腺癌細胞株Panc02、人胰腺癌細胞株Mia-paca2購于美國ATCC細胞庫。

1.2 試劑和儀器 RPMI-1640培養基、DMEM高糖培養基購自中國基諾生物醫藥技術有限公司，規格250ml；PBS、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、甲醇購自上海化學試劑有限公司，規格250ml；結晶紫購自上海生工生物有限公司，規格5g；地塞米松購自日本Sigma公司，規格5g；0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，規格500ml；FBS購自以色列BI公司，規格500ml。Transwell（3422）購自美國Corning公司；MatrigelTM細胞侵襲小室購自美國BD Biosciences公司。

1.3 細胞培養及藥物處理 小鼠胰腺癌細胞株Panc02、人胰腺癌細胞株Mia-paca2分別常規培養于含10%FBS的RPMI-1640培養基和DMEM高糖培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育，每周傳代2～3次。按實驗需求接種細胞于培養板內，繼續培養24h后棄去原培養液，預溫的PBS清洗細胞2～3遍以去除血清中激素對細胞的影響，將2株細胞分別分為地塞米松處理組和對照組，地塞米松處理組加入含10-7mol/L地塞米松的去激素血清培養液，對照組加入等體積含1‰無水乙醇的培養基。

1.4 細胞增殖實驗 將生長狀態良好的細胞接種于96孔板，每孔細胞數1 000～3 000個，培養箱中孵育過夜后給予相應藥物處理不同時間（24、48、72h），棄去培養液，每孔加入150μl DMSO充分震蕩溶解細胞后，采用酶聯免疫檢測儀檢測其在570nm波長處的吸光度（OD）值。

1.5 細胞黏附實驗 細胞經藥物預處理24h，胰酶消化制成單細胞懸液，接種8×104個/200μl細胞于96孔板，繼續培養45min后，PBS輕洗去除未貼壁細胞。每孔加入150μl DMSO充分震蕩溶解剩余貼壁細胞后，采用酶聯免疫檢測儀檢測其在570nm波長處的OD值。

1.6 細胞劃痕實驗 將生長狀態良好的細胞接種于12孔板（種板數以第2天細胞長滿為宜），培養箱培養過夜；第2天用無菌的10μl槍頭于培養板孔底部均勻劃痕，PBS輕洗后拍照并標記，按組別給予相應藥物處理24h，于100倍鏡下觀察劃痕融合情況，固定視野拍照。并通過畫圖軟件測量24h時劃痕寬度及起始劃痕寬度，兩者比值得出劃痕愈合百分比（%），進而體現細胞水平遷移能力。

1.7 細胞侵襲實驗

1.7.1 預平衡 于24孔板中加入800μl不含血清的培養液，將Transwell小室和侵襲小室置于24孔板內，37℃培養箱中平衡1h。

1.7.2 細胞處理 接種細胞于6孔板，經過夜培養后，給予相應藥物處理24h；細胞經胰酶消化制成單細胞懸液(兩組持續給予相應藥物)，以每孔 4×104個細胞/200μl接種于預平衡處理過的Transwell小室和侵襲小室內，置培養箱中繼續培養。

1.7.3 固定染色 24h后，吸去Transwell小室和侵襲小室中殘液，棉簽輕輕拭去上室側的細胞，后置于冰甲醇中固定10～15min，置于0.1%結晶紫染液中染色15～20min；PBS清洗后晾干，每孔隨機取5個視野于100倍鏡下計數并拍照。

2 結果

2.1 地塞米松對胰腺癌細胞增殖能力的影響 胰腺癌細胞株Panc02和Mia-paca2的增殖能力隨著培養時間的延長而逐漸增強，但地塞米松處理組在各個時間點（24、48、72h）與對照組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖 1。

圖1 地塞米松對胰腺癌細胞Panc02和Mia-paca2增殖能力的影響

2.2 地塞米松對胰腺癌細胞與細胞外基質黏附能力的影響 胰腺癌細胞株Panc02和Mia-paca2經10-7mol/L地塞米松處理24h后，細胞與細胞外基質的黏附能力較對照組細胞明顯增強，分別約為對照組的1.8倍和2倍（均P＜0.05），提示地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細胞與細胞外基質的黏附能力，見圖2。

圖2 地塞米松對胰腺癌細胞Panc02和Mia-paca2黏附能力的影響（與對照組比較，*P＜0.05）

2.3 地塞米松對胰腺癌細胞遷移能力的影響 經10-7mol/L地塞米松處理24h后，胰腺癌細胞株Panc02和Mia-paca2的垂直遷移能力顯著增加，分別約為對照組的 8倍和 2.5倍（均P＜0.05）（圖 3a－b，見插頁）；進一步采用細胞劃痕實驗觀察了地塞米松對胰腺癌細胞株Panc02和Mia-paca2水平遷移的影響，發現地塞米松處理組胰腺癌細胞的水平遷移能力明顯增強（均P＜0.05）（圖3c-d，見插頁），提示地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細胞的遷移能力。

2.4 地塞米松對胰腺癌細胞侵襲能力的影響 經10-7mol/L地塞米松處理24h后，胰腺癌細胞株Panc02和Mia-paca2的侵襲能力顯著增強，分別約為對照組的6倍和3.5倍（均P＜0.05），提示地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細胞的侵襲能力，見圖4（插頁）。

3 討論

腫瘤的發生、發展是個非常復雜的過程，除了致瘤因素導致的細胞多步驟多基因突變而產生的增殖、分化、凋亡、遷移等調控環節失常外，還受免疫系統、腫瘤微環境及體內神經內分泌等多重因素的影響[7]。而作為體內重要神經內分泌激素之一的GCs除了具有強大的抗炎和免疫抑制外，還能夠直接調控正常或惡變細胞的增殖、分化及凋亡。以往研究表明，GCs對多種實體腫瘤均產生生物學效應，如地塞米松能夠抑制非小細胞肺癌、肝癌等的增殖，能夠促進乳腺癌、前列腺癌等在低血清或化療藥物作用下的存活[8-11]。盡管如此，GCs對胰腺癌的生物學效應，特別是胰腺癌細胞的遷移、侵襲還不清楚。

Benz等[5]發現GCs能夠抑制小鼠胰腺癌AR42j細胞的增殖。Norman等[6]研究也發現地塞米松能夠抑制人胰腺癌細胞的增殖，且該效應是劑量依賴性的。而本實驗發現10-7mol/L地塞米松在處理72h內未能明顯改變2株胰腺癌細胞的增殖，可能與地塞米松作用的時間較短，未發現明顯增殖抑制效果有關。本實驗還發現10-7mol/L地塞米松能明顯增強胰腺癌細胞與其細胞外基質的黏附能力。由于腫瘤細胞與其細胞外基質的黏附能力增強能夠激活整合素信號通路，通過激活PI3K/Akt通路促進細胞的存活，是腫瘤細胞產生化療藥物抵抗的機制之一[12-13]。本研究提示地塞米松能夠通過增強胰腺癌細胞的黏附能力，從而增加其對化療藥物的抵抗能力。

本實驗還研究了10-7mol/L地塞米松對2株不同胰腺癌細胞遷移和侵襲生物學行為的影響。結果發現地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力，提示GCs對于胰腺癌細胞體內的轉移有促進作用，而該促進作用與其促進胰腺癌細胞自身的遷移侵襲有關。另外，Piette等[14]研究顯示，在嚴重聯合免疫缺陷（SCID）小鼠的移植瘤模型中，地塞米松能抑制神經膠質瘤的進展和轉移。但也有報道在荷瘤裸鼠模型中地塞米松處理的結腸癌HT-29細胞肝臟轉移瘤的數目明顯增多[15]。由此看出，在不同的腫瘤細胞中地塞米松對其侵襲轉移的生物學作用體現出不一致性，提示GCs對腫瘤侵襲轉移的生物學作用具有腫瘤細胞特異性。GCs對機體的影響更是多方面的復雜過程，因此在整體實驗中證實GCs對于胰腺癌細胞遷移、侵襲等生物學行為的影響更具有臨床意義。前期Egberts等[16]報道顯示，在SCID小鼠的移植瘤模型中，地塞米松能夠抑制胰腺細胞癌的進展和轉移。該結果與本實驗結果不甚一致，由于采用此種小鼠的結果并不能真實說明GCs在整體中對胰腺癌細胞轉移和進展的作用。因此，有必要采用更好的動物模型更深入的研究體內GCs對胰腺癌細胞遷移、侵襲和轉移的影響，這也是筆者下一步實驗研究的重點。

機制方面，Békási等[17]研究發現在正常胰腺組織和胰腺癌中GR分布有明顯不同，這提示了GCs/GR信號通路調控的下游靶蛋白在胰腺癌的發生、發展中具有重要的作用。Huang等[18]研究發現細胞骨架蛋白ROCK介導了GCs促進黑色素瘤的體外遷移、侵襲和體內肺轉移的效應。另外，Hidalgo等[19]、Smith等[20]研究發現GCs還可影響腫瘤微環境中的間質成分發揮促腫瘤侵襲轉移的生物學效應。以上研究表明，GCs可以通過直接作用于腫瘤細胞來影響其遷移及侵襲，也可以影響腫瘤組織局部（微環境）調控腫瘤細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，本實驗發現應激或藥理劑量的GCs能夠明顯增強胰腺癌細胞的黏附、遷移和侵襲能力，但對其增殖能力沒有明顯影響。該發現有助于進一步闡明應激狀況下GCs對胰腺癌發生、發展的作用，從而進一步認識應激激素與實體腫瘤的關系。