高膽固醇飲食對兔腦血流量和β-淀粉樣蛋白1-42水平的影響

金平 潘永明 潘智勇 徐劍欽 林敏 佟雅涵 陳民利 許茂盛

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的神經退行性疾病，其臨床特征是進行性的記憶力減退和認知功能障礙，患者最終多因并發癥死亡[1]。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）異常聚集和沉積所形成的老年斑是AD的主要病理特征，其中Aβ1-42是形成老年斑的主要成分，在AD發病機制中占有重要的作用[2]。報道顯示到本世紀中期，全球老年癡呆患者的數量將過億[3]。但是目前為止，AD的病因尚未完全闡明。相對于少見的家族性和早顯性AD，臨床上多見的晚發性AD發病機制更加復雜多樣[4]，研究顯示膽固醇代謝在晚發性AD發病中發揮了重要作用[5]。同時有研究認為AD是一種由腦缺血所觸發的神經變性疾病[6]。長期的低血流灌注可以造成腦組織能量供給障礙，神經細胞發生氧化應激、炎性反應而引起損傷，并最終導致進行性的認知功能障礙[7]。本研究旨在探討高膽固醇飲食對大白兔腦血流量（cerebral blood flow，CBF）和腦組織Aβ1-42水平的影響，并分析血清TC、CBF及Aβ1-42水平的相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 普通級3～4月齡雄性日本大耳白兔12只，體質量2.5～3.0kg，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心普通級兔實驗室[SYXK（浙）2013-0164]提供并飼養，室內溫度：18～22℃，相對濕度：40%～60%，12h/12h明暗交替。采用隨機數字表法分為高膽固醇組和常規飲食組各6只，高膽固醇組以2%膽固醇飲食喂養，常規飲食組以常規基礎飲食喂養，12周后行血液檢測和MRI分析。所有實驗動物使用符合動物實驗學的3R原則。

1.2 兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平檢測 抽取兔耳緣靜脈血，采用日立7020全自動生化分析儀和試劑盒（上海德賽診斷技術有限公司）檢測血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

1.3 兔腦CBF檢測 采用Discovery MR750 3.0T磁共振成像系統（美國GE公司），配備兔腦專用線圈（上海晨光公司）。主要MR掃描序列包括：軸位3DT1BRAVO、T2WI和動脈自旋標記（3D-ASL）。3D-ASL序列標記后延遲時間1 525ms，其他主要序列及掃描參數見表1。

實驗兔禁食不禁水12h后，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉，待麻醉穩定后，將實驗兔以臥位固定并將頭頸部放入動物專用線圈位置中，確保兔保持呼吸順暢和心跳平穩。掃描完成后，將3D-ASL

原始數據傳輸至Sun Workstation ADW 4.2（美國GE公司），采用工作站自帶軟件Functool對ASL原始數據進行圖像矯正等預處理，獲得CBF參數圖，在雙側皮質及海馬設置4個感興趣區，測得CBF平均值，記錄數據。由2位MR醫師單獨進行圖像后處理，圖像中紅色代表高灌注，藍色代表低灌注。

1.4 兔腦皮質、海馬Aβ1-42水平測定 經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉后處死并取腦，分離皮質和海馬。使用IKA ULTRA-TURRAX勻漿機（德國希而科有限公司）將腦皮質和海馬制備成10%的腦組織勻漿，4℃離心，4 500r/min離心10min，取上清液進行檢測。使用ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定Aβ1-42含量，嚴格按照說明書操作。采用考馬斯亮藍法測定腦組織總蛋白質量[8]。Aβ1-42水平以Aβ1-42含量/腦組織總蛋白質量表示，單位為pg/mg。

1.5 統計學處理 采用GraphPad Prism 4.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；血清TC、CBF與Aβ1-42水平的相關性分析采用Person相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較 高膽固醇組兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平均明顯高于常規飲食組，兩組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

表1 MR掃描序列主要成像參數

表2 兩組兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較（mmol/L）

2.2 兩組兔腦皮質、海馬CBF比較 CBF參數圖顯示高膽固醇組兔腦皮質、海馬血流灌注低于常規飲食組，見圖1（插頁）。高膽固醇組兔腦皮質、海馬CBF分別為（16.94±4.35）和（12.53±3.90）ml/（min·100g），均明顯低于常規飲食組的（25.56±6.58）和（20.26±5.72）ml/（min·100g），兩組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

2.3 兩組兔腦皮質、海馬Aβ1-42水平比較 高膽固醇

圖2 兩組兔腦皮質、海馬CBF比較（a：兩組兔腦皮質CBF比較；b：兩組兔腦海馬CBF比較；與常規飲食組比較，*P＜0.05）

2.4 兔血清TC、CBF和Aβ1-42水平的相關性分析 血清TC與皮質、海馬Aβ1-42水平均呈正相關（r=0.774和0.649，均P＜0.05），見圖4a-b；血清TC 與皮質、海馬 CBF組兔腦皮質、海馬 Aβ1-42水平分別為（149.56±24.26）和（216.58±50.44）pg/mg，均明顯高于常規飲食組的（132.40±13.75）和（151.30±23.76）pg/mg，兩組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。均呈負相關（r=-0.845 和-0.783，均P＜0.01），見圖 4c-d；皮質、海馬Aβ1-42水平與CBF均呈負相關（r=-0.637和-0.602，均P＜0.05），見圖 4e-f。

圖3 兩組兔腦皮質、海馬Aβ1-42水平比較（a：兩組兔腦皮質Aβ1-42水平比較；b：兩組兔腦海馬Aβ1-42水平比較；與常規飲食組比較，*P＜0.05）

圖4 兔血清TC、CBF與Aβ1-42水平的相關性分析

3 討論

Aβ的異常聚集和沉積是AD發病機制中的重要環節[5，9]。在正常的生理狀態下，Aβ的產生和降解處于動態的平衡之中，當體內外的某些因素打破這個動態的平衡，β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）的代謝便會出現異常，引起Aβ的生成增多和（或）降解減少，最終導致Aβ在腦內的大量沉積。

目前研究認為膽固醇代謝紊亂在AD的發病中扮演著重要角色[10]。膽固醇參與Aβ產生、聚集沉積及降解，高膽固醇血癥可增加大腦中Aβ的沉積，并損害學習和記憶功能[11]。根據Smith[12]的假說，AD的發病始于海馬，隨著疾病進展，海馬內神經元的減少導致其所投射的其他神經皮層內神經元代謝減緩、逐漸死亡。腦皮質尤其是海馬的萎縮是AD患者在MRI上的特征性改變[13]。所以本課題組在成功獲得兔高膽固醇模型后，選取兔腦皮質、海馬進行Aβ1-42水平檢查，結果顯示兩組兔血清TC與皮質、海馬Aβ1-42水平均呈正相關，且高膽固醇組兔腦皮質、海馬Aβ1-42水平均明顯高于常規飲食組，兩組比較差異均有統計學意義，提示高膽固醇血癥能促進Aβ在腦內的沉積，這與目前研究結論相符[14-15]。血清TC水平的升高可能通過改變細胞膜和細胞內TC的分布影響APP在細胞膜中的定位，從而增強β-分泌酶和γ-分泌酶的活性，使Aβ的產生增多；同時TC也可以抑制α-分泌酶的活性，間接使Aβ的產生增加[16-17]。此外TC可以通過調節包括胰島素降解酶（insulin degradation enzyme，IDE）等諸多參與 Aβ 降解的一系列酶的表達和活性促進Aβ的沉積。IDE是一種主要表達于神經元和神經膠質細胞的鋅金屬肽鏈內斷酶，對胞外的Aβ降解具有重要作用，其部分亞基存在于脂筏微域中，細胞膜TC水平升高可直接影響IDE的功能，導致Aβ降解減少[18]。

血清TC水平升高可引起血管內皮損傷，從而導致內皮脫落，組織因子釋放，激活體內凝血系統，使體內出現高凝狀態，導致血流緩慢，腦血流灌注減少[19]。本課題組利用MRI 3D-ASL序列檢測兔腦皮質、海馬CBF，結果顯示高膽固醇組兔腦皮質、海馬CBF均明顯低于常規飲食組，且兩組血清TC與皮質、海馬CBF均呈負相關，與孫明等[19]研究結果相仿。

基于大鼠雙側頸動脈結扎的慢性腦缺血模型研究顯示腦內長期低灌注可使腦內APP及Aβ水平明顯升高，可能與長期低血流灌注激活了APP基因并增強了β-分泌酶的活性有關[20-21]。異常沉積在周圍供血小動脈及毛細血管基膜上的Aβ可增強內皮細胞所分泌的內皮素的收縮血管作用，引起腦血管收縮，加重腦的低血流灌注，導致Aβ進一步沉積，從而形成惡性循環[22]。本研究結果也顯示兔腦皮質、海馬Aβ1-42水平與CBF均呈負相關。此外當腦內出現低血流灌注時，腦內的神經膠質細胞，包括小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞均可出現明顯的增生和活化，引起免疫炎性反應[23-24]，并最終導致神經元凋亡[25]。AD的免疫炎性反應機制同樣指出免疫炎性反應參與AD的整個病理進程：老年斑的形成過程中始終伴隨膠質細胞的增生及炎性細胞因子過量產生[26]，表明慢性腦缺血可以通過免疫炎性反應促進AD的發生。

目前膽固醇異常代謝學說及慢性腦缺血觸發學說指出高膽固醇血癥及慢性腦缺血在AD的發病中起著重要作用。筆者之前通過高膽固醇飲食誘導的AD兔模型腦內出現皮質、海馬的萎縮和腦室擴張等AD特征樣改變[27]，進一步驗證了AD的膽固醇異常代謝學說。根據文獻[12-13]，本研究選取并測量了兔腦皮質、海馬CBF，結果顯示兔腦CBF明顯降低，兔腦皮質、海馬Aβ1-42水平與CBF均呈負相關，筆者推測高膽固醇誘導AD的發生，不僅僅是基于其可以改變TC在神經元膜、細胞內的分布，或在強化APP淀粉樣途經的同時抑制非淀粉樣途徑等作用，它還可以通過其引起的低血流灌注促進腦內Aβ的異常沉積。

綜上所述，高膽固醇飲食能引起腦海馬、皮質CBF的減少和Aβ1-42水平的升高，繼發于高血脂的低血流灌注可能參與并促進了Aβ1-42在腦內的異常沉積。