宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表達及臨床意義

曹學全 胡金蒙 楊朝暉 盧洪勝 魏科娜 章輝 顧華敏

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于乳腺癌居第2位，死亡率居第4位[1-2]。宮頸癌的發生、發展與多種因素、多種基因的聯合作用有關，其預后受多種因素影響，治療效果并不十分理想[3]。因此，尋找宮頸癌的特異性治療靶點具有重要臨床意義。磷脂酰乙醇胺結合蛋白4（phosphatidylethanolamine binding protein 4，PEBP4）屬于PEBP家族的一個新成員，在細胞膜合成、成肌細胞分化、神經發育和腫瘤發生等生物學過程中起重要作用[4]。有研究證實PEBP4表達上調與腫瘤細胞增殖、侵襲及耐藥相關[5-6]。PEBP4過表達可增加肺癌細胞中蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的磷酸化水平。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3kinase，PI3K）/Akt/mTOR信號軸可能是PEBP4促進非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲的關鍵分子途徑[7]。本研究應用實時熒光定量PCR法及免疫組化En Vision法分別檢測48例宮頸癌和48例正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA和蛋白的表達差異，分析其表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系及宮頸癌組織中PEBP4和mTOR表達的相關性，初步從基因及蛋白水平探討其在宮頸癌發生、發展中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2008年6月至2013年12月在本院手術切除的宮頸癌標本48例，患者術前均未接受化療、放療及免疫治療等，年齡 28～73（48.0±11.0）歲。參照 WHO宮頸癌組織學分類（2003）進行組織學分化程度的判斷。選取同期因子宮肌瘤行子宮全切術的正常宮頸組織標本 48 例作為對照，患者年齡 32～61（44.5±6.7）歲。每例標本的1/2在離體后20min內放入-80℃低溫冰箱保存，用于實時熒光定量PCR檢測；另1/2以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司，PIPA裂解液、cDNA試劑盒、SYBR Green熒光染料均購于溫州長豐生物科技公司。PEBP4山羊抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，mTOR兔抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術有限公司，En Vision通用試劑盒及DAB均購自廣州基因公司。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測PEBP4和mTOR mRNA表達水平 設計PEBP4和mTOR基因PCR引物序列，具體如下：PEBP4 正 向 ：5′-ACTGGGTCTCATGATGGTGG-3′，反向：5′-CTCCATCCAGGAGGTGATCT-3′；mTOR 正向：5′-GCAGGAATAGCAAGAACTCG-3′，反向：5′-CCTCACAGCCACAGAAAGTAG-3′；內參 GADPH正向：5′-GCTCACCATGGATGATGATATC-3′，反向：5′-GCCAGATTTTCTCCATGTCGTC-3′，所有引物均由溫州長豐生物科技公司合成。-80℃低溫冰箱保存的標本，冰上操作，提取總RNA并檢測純度，然后轉染成cDNA反應體系，37℃孵育60min。采用SYBR Green熒光染料，嚴格按照試劑盒說明書完成40個PCR循環。產生的熔解曲線和擴增曲線表明PCR擴增效率恒定，且已達到平臺期，引物特異性好且無引物二聚體產生。收集熒光信號進行結果分析。

表1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平比較

1.4 免疫組化檢測PEBP4和mTOR蛋白表達 石蠟切片常規脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10min，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復，3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min，分別加入一抗（PEBP4、mTOR抗體濃度分別為1:200和1:100）4℃過夜，再加入二抗，DAB顯色，蘇木素復染，封片后光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性組織作陽性對照。PEBP4表達定位于細胞質和細胞膜，mTOR表達定位于細胞質，呈現淡黃色或棕黃色顆粒分布為陽性細胞。在光學顯微鏡下，每張切片隨機選取5個高倍視野，觀察并記錄細胞染色強度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。記錄陽性細胞數百分比：陽性細胞數百分比≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為 3分，＞75%為4分。細胞染色強度與陽性細胞百分比計分的乘積為每例的最終積分。＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料組間比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表達的相關性分析采用Spearman等級相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平比較 宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表1。PEBP4、mTOR和GADPH的實時熒光定量PCR的熔解曲線和擴增曲線見圖1。

圖1 PEBP4、mTOR和GADPH的熔解曲線和擴增曲線（a：PEBP4熔解曲線；b：mTOR熔解曲線；c：GADPH熔解曲線；d：PEBP4擴增曲線；e：mTOR 擴增曲線；f：GADPH 擴增曲線）

2.2 PEBP4和mTOR mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 PEBP4 mRNA表達水平與宮頸癌浸潤肌層、淋巴結是否轉移和臨床分期均有關（均P＜0.01），而與患者的年齡和分化程度均無關（均P＞0.05）。mTOR mRNA表達水平與宮頸癌患淋巴結是否轉移和臨床分期均有關（均P＜0.01），而與患者的年齡、分化程度和浸潤肌層均無關（均P＞0.05），見表2。

表2 PEBP4和mTOR mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR蛋白表達比較 PEBP4和mTOR蛋白在宮頸癌組織中呈強表達，而在正常宮頸組織中呈弱表達或陰性表達，見圖2（插頁）。宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達的陽性率分別為 72.92%（35/48）和 66.67%（32/48），明顯高于正常宮頸組織的 10.42%（5/48）和 8.33%（4/48），差異均有統計學意義（χ2=38.571和34.844，均P＜0.01）。

2.4 PEBP4和mTOR蛋白表達陽性率與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 PEBP4蛋白表達陽性率與宮頸癌浸潤肌層、淋巴結是否轉移和臨床分期均有關（均P＜0.05），而與患者的年齡和宮頸癌分化程度均無關（均P＞0.05）。mTOR蛋白表達陽性率與宮頸癌淋巴結是否轉移和臨床分期均有關（均P＜0.05），而與患者的年齡、宮頸癌分化程度和浸潤肌層均無關（均P＞0.05），見表3。

表3 PEBP4和mTOR蛋白表達陽性率與宮頸癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.5 宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表達的相關性 Spearman等級相關分析顯示，48例宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平呈正相關（r=0.645，P=0.000）。48例宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達均陽性30例，均陰性11例，宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白陽性表達呈正相關（r=0.663，P=0.000），見表4。

表4 宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達的相關性（例）

3 討論

PEBP家族是由一類具有與磷脂酰乙醇胺結合能力的堿性蛋白所組成，廣泛表達于多種植物和動物。PEBP4是PEBP家族的一個新成員，該家族成員都有類似的結構域[8]。PEBP4在肌肉組織中有表達，在成肌細胞分化期間，PEBP4和Raff/MEK信號通路之間可相互調控。干擾PEBP4的表達可抑制成肌細胞分化，可能與Raff/MEK信號通路的激活有關。此外，PEBP4過表達引起Akt激活，同時抑制ERK/JNK的活性[7]。有研究表明PEBP4在多種腫瘤標本中的表達均增加，與腫瘤的侵襲和轉移相關，說明PEBP4在腫瘤的進展過程中起著重要的作用[6-7,9]。Huang等[10]研究發現，與低級別膠質瘤和正常腦組織比較，高級別膠質瘤PEBP4表達明顯升高。多因素Cox回歸分析顯示PEBP4表達升高是膠質瘤預后的獨立因素。PEBP4低表達的患者較那些PEBP4高表達的患者有更長的生存時間。這些數據表明，PEBP4作為預測神經膠質瘤患者腫瘤的分級和預后具有一定的臨床意義。本研究發現宮頸癌組織中PEBP4 mRNA表達水平和蛋白表達陽性率均明顯高于正常宮頸組織，與Wu等[11]在胃癌中的研究結果一致。本研究發現隨著臨床分期進展、浸潤肌層加深和淋巴結發生轉移，PEBP4 mRNA和蛋白表達逐漸升高，差異均有統計學意義。表明PEBP4 mRNA和蛋白高表達者，宮頸癌臨床分期較高，較容易發生侵襲和淋巴結轉移。Wu等[11]研究發現，沉默PEBP4的表達對胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移有明顯的抑制作用。此外，PEBP4過表達可通過激活PI3K/Akt信號通路，促進胃癌細胞的發生、發展和侵襲[11]。

mTOR是重要的絲氨酸/蘇氨酸蠶白激酶之一，是PI3K/Akt/mTOR信號通路的關鍵信號轉導分子。PI3K/Akt/mTOR通路是最重要的細胞內信號通路之一。通過影響其下游多個效應分子的活化狀態，調節細胞的增殖、凋亡、分化和代謝等一系列關鍵生理活動[12]。近年來，在多種惡性腫瘤中已發現PI3K/Akt/mTOR途徑的異常活化，同時，該途徑的激活也可能在腫瘤細胞過度增殖和阻斷細胞凋亡中起關鍵作用[13-14]。本研究顯示，mTOR mRNA和蛋白在正常宮頸組織均低表達，而在宮頸癌組織中表達明顯升高，并且隨著宮頸癌臨床分期進展和淋巴結發生轉移，表達水平進一步提高，差異均有統計學意義。提示mTOR mRNA和蛋白高表達與宮頸癌的轉移密切相關，且患者臨床分期高，預后差。

Yu等[7]報道，PEBP4的過表達促進Akt和mTOR的磷酸化，而沉默PEBP4的表達可抑制Akt和mTOR的磷酸化。因此，PEBP4可以通過PI3K/Akt/mTOR途徑對肺癌細胞發揮其生物學作用。本研究中Spearman等級相關分析顯示，PEBP4和mTOR mRNA表達水平和蛋白陽性表達均呈正相關。提示PEBP4過表達可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路，導致mTOR mRNA和蛋白表達升高，進而促進宮頸癌的發生、發展。

綜上所述，本研究宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表達明顯升高，且均與宮頸癌的臨床分期和轉移有關，PEBP4在浸潤肌層有意義，而mTOR無明顯意義，可能與本研究標本量較少有關。宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平和蛋白陽性表達均呈正相關，提示兩者可能在同一信號通路中起調控作用。本研究為下一步采用RNA干擾和細胞培養等技術探討沉默PEBP4表達是否能夠抑制宮頸癌細胞侵襲和轉移能力及調控的具體機制如何提供了理論基礎和實驗依據，PEBP4有望成為宮頸癌特異性治療的新靶點。