卵巢癌細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽的篩選及鑒定

李文桔 王樂丹 趙宇

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，雖然發(fā)病率低于宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌，但由于早期診斷困難，70%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，治療效果亦不理想，病死率已居?jì)D科惡性腫瘤首位[1]。目前臨床上用于診斷及監(jiān)測卵巢癌及腫瘤治療后復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物主要為CA125，但50%～60%的Ⅰ期卵巢癌患者 CA125水平并未升高[2]。此外，CA125水平升高也見于月經(jīng)期、孕早期、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢良性腫瘤或其他一些惡性腫瘤。因此，臨床上需要陽性預(yù)測值更高的腫瘤指標(biāo)用于早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌。目前由Smith等[3]創(chuàng)建的噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是篩選腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽的強(qiáng)有力、高通量的一種生物學(xué)技術(shù)[4]。該技術(shù)以噬菌體為載體，將外源基因插入噬菌體的基因組中，從而使其表達(dá)的外源多肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白以融合的形式展示在噬菌體表面，展示的外源多肽或蛋白并不影響噬菌體自身結(jié)構(gòu)及功能，而且可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性。本研究利用噬菌體隨機(jī)七肽庫篩選卵巢癌細(xì)胞HO-8910表面特異性結(jié)合肽，以期為卵巢癌的早期診斷提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 卵巢癌細(xì)胞株HO-8910購自上海拜力生物科技有限公司，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和卵巢癌細(xì)胞株SKOV3均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫，文庫滴度為2×1013pfu/ml的噬菌體隨機(jī)七肽庫購自美國New England Biolabs公司，抗M13單抗和HRP-抗M13單抗均購自美國GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體生物淘洗 消化、收集細(xì)胞株HO-8910，重懸于含1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM無血清培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/ml；加入噬菌體隨機(jī)七肽庫10μl于4℃共同孵育2h；將混懸液與事先配置的有機(jī)分離液200μl（鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷組成，體積比為9∶1，密度為1.03g/ml)混合，低溫離心機(jī)10 000g離心10min；轉(zhuǎn)移EP管底的沉淀物至200μl的處于對數(shù)生長期的ER2738大腸桿菌菌液，細(xì)菌培養(yǎng)箱孵育30min，而后測滴度、擴(kuò)增、純化，進(jìn)入下一輪淘洗，計(jì)數(shù)每一輪淘洗后和擴(kuò)增后的噬菌體數(shù)目，計(jì)算回收率，如此重復(fù)3個(gè)循環(huán)。

1.2.2 ELISA法檢測細(xì)胞株HO-8910與唑菌體單克隆的親和力 96孔板內(nèi)加入含104/孔的HO-8910細(xì)胞懸液，固定20min；封閉液（含1%BSA）封閉1h；分別加入在第3輪淘洗后獲得的21個(gè)噬菌體單克隆（1.0×1010pfu/孔），設(shè)定PBS和M13K07為陰性對照，細(xì)菌培養(yǎng)箱里孵育 2h；加入 HRP-抗 M13 單抗（1∶6 000）共同孵育2h；TMB顯色液顯色，微板閱讀器設(shè)置在405nm，如果隨機(jī)克隆的OD值＞2.1倍的陰性對照克隆的OD值，即P/N值＞2.1，就表示此克隆對細(xì)胞有高親和力。

1.2.3 噬菌體DNA測序 根據(jù)ELISA結(jié)果，選取其中親和性較高的17個(gè)噬菌體，提取噬菌體DNA，通過基因序列推導(dǎo)出多肽序列，計(jì)算重復(fù)噬菌體數(shù)量。

1.2.4 噬菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 分別收集細(xì)胞數(shù)為1×107/ml的HO-8910、PANC-1、SKOV3細(xì)胞懸浮液；分別加入10μl噬菌體MRMTIIN與這3種細(xì)胞低溫孵育2h；離心、復(fù)蘇、測滴度，計(jì)算不同細(xì)胞噬菌體結(jié)合率（洗脫后的噬菌體滴度/淘洗加入噬菌體滴度）。

1.2.5 免疫細(xì)胞染色 分別將細(xì)胞株HO-8910、PANC-1、SKOV3以每孔1.0×104/ml接種于細(xì)胞爬片上，多聚甲醛固定15min；BSA封閉20min；分別加入噬菌體MRMTIIN和 M13K07噬菌體（1.0×1010pfu/孔），37℃共同孵育2h，PBS為陰性對照；滴加1∶100倍比稀釋的HRP-抗M13單抗孵育2h；將細(xì)胞爬片取出后置于載玻片上，在顯微鏡下滴加DAB顯色液觀察細(xì)胞顯色情況，后蘇木素染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡下拍片存檔，細(xì)胞上有棕黃色顆粒提示陽性。

1.2.6 免疫熒光染色 分別將細(xì)胞株HO-8910、PANC-1、SKOV3接種于載玻片上，步驟同免疫細(xì)胞染色，加入1∶100倍比稀釋的抗M13抗體共同孵育2h；加入熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶300）于37℃共同孵育0.5h；1∶5 000的DAPI染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下立即觀察顯色情況。

1.2.7 競爭抑制實(shí)驗(yàn) 不同稀釋梯度的多肽MRMTIIN或?qū)φ针腞MTIINM與HO-8910細(xì)胞懸液低溫孵育0.5h，再加入1.0×109pfu的噬菌體MRMTIIN低溫孵育2h；隨后步驟同噬菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，多肽濃度最高為500μmol/L，最低為 0.01μmol/L，以 10 倍比逐漸稀釋，總共有6個(gè)稀釋度，其中多肽濃度為0μmol/L時(shí)，噬菌體滴度為100%，實(shí)驗(yàn)組共有7組，多肽濃度分別為0、0.01、0.1、1、10、100、500μmol/L，觀察相同濃度不同多肽的菌斑數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 陽性噬菌體的富集 本實(shí)驗(yàn)利用噬菌體隨機(jī)七肽庫對卵巢癌HO-8910細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞篩選，計(jì)算每輪回收率。結(jié)果顯示第3輪回收率為4.6×10-4，與第1輪相比增加了306倍，由此提示噬菌體得到有效的富集，見表1。

表1 噬菌體七肽庫篩選卵巢癌細(xì)胞株表面特異性多肽

2.2 陽性噬菌體親和力鑒定 隨機(jī)挑選第3輪淘洗后平板中獲得的21個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示有17個(gè)噬菌體P/N值均＞2.1，見圖1。

圖1 ELISA法檢測細(xì)胞株HO-8910與噬菌體單克隆的親和力

2.3 DNA序列測定 選擇ELISA試驗(yàn)中P/N值高的17個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行DNA序列測定，結(jié)果顯示17個(gè)噬菌體單克隆中有9種不同噬菌體，其中展示Met-Arg-Met-Thr-Ile-Ile-Asn（MRMTIIN）序列的噬菌體有7個(gè)，出現(xiàn)頻率最高，見表2。

表2 噬菌體單克隆的序列分析及多肽序列

2.4 陽性噬菌體特異性鑒定

2.4.1 噬菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 噬菌體MRMTIIN與細(xì)胞株HO-8910結(jié)合率最高，提示噬菌體MRMTIIN與HO-8910有較高的親和力和特異性，見表3和圖2。

表3 噬菌體MRMTIIN與不同細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)

2.4.2 免疫細(xì)胞染色 HO-8910細(xì)胞表面可見棕黃色顆粒，說明噬菌體MRMTIIN能與HO-8910細(xì)胞結(jié)合（圖3a，見插頁），而PANC-1、SKOV3細(xì)胞表面未見棕黃色顆粒，說明噬菌體MRMTIIN不能與PANC-1細(xì)胞（圖3b，見插頁）和SKOV3細(xì)胞（圖3c，見插頁）結(jié)合；而對照組所有細(xì)胞均未見棕黃色顆粒，說明對照噬菌體M13K07均不與這3種細(xì)胞結(jié)合（圖3d-f，見插頁）。

圖2 噬菌體MRMTIIN與不同細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)

2.4.3 免疫熒光染色 HO-8910細(xì)胞表面可見綠色熒光提示噬菌體MRMTIIN能與HO-8910細(xì)胞結(jié)合，故免疫熒光染色結(jié)果與免疫細(xì)胞染色結(jié)果一致。噬菌體MRMTIIN選擇性與HO-8910細(xì)胞結(jié)合（圖4a，見插頁），而與PANC-1細(xì)胞（圖4b，見插頁）和SKOV3細(xì)胞（圖4c，見插頁）均不結(jié)合，而對照噬菌體M13K07則均不與這3種細(xì)胞結(jié)合（圖4d-f，見插頁）。

2.4.4 競爭抑制實(shí)驗(yàn) 隨著合成多肽濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量逐漸減少；而含有相同氨基酸但排列順序不同的對照肽RMTIINM，隨著濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量未見明顯改變，說明多肽MRMTIIN能有效抑制噬菌體MRMTIIN與卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的結(jié)合，見圖5-6。

圖5 合成多肽對噬菌體MRMTIIN與細(xì)胞HO-8910結(jié)合的抑制作用

3 討論

圖6 合成多肽對噬菌體MRMTIIN與細(xì)胞HO-8910結(jié)合的抑制作用

噬菌體展示技術(shù)[5]是以改造的噬菌體為載體，將外源多肽或蛋白質(zhì)的基因插入噬菌體的基因組中，插入的外源基因并不影響噬菌體自身結(jié)構(gòu)及功能，隨著子代噬菌體的重新組裝，插入的外源多肽繼而以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面；將改造的噬菌體與靶分子共同孵育一段時(shí)間，通過離心等方法洗去未結(jié)合及親和性較弱的噬菌體，然后讓親和性較高的噬菌體從靶分子中洗脫下來進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”，陽性噬菌體就能得到高度富集；通過基因序列測定分析，進(jìn)而推導(dǎo)出相應(yīng)多肽的結(jié)構(gòu)和功能，因此，預(yù)先不需要知道目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)信息。目前各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中能實(shí)現(xiàn)基因型和表型統(tǒng)一的就只有噬菌體展示技術(shù)[6]。經(jīng)過20多年的發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體制備、腫瘤抗原篩選、生物疫苗、藥物研制等[7-8]方面。

利用噬菌體展示技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合的小分子多肽[9]。國內(nèi)外利用噬菌體展示技術(shù)在體外已成功篩選出各種抗腫瘤短肽，如膀胱癌[10]、肺癌[11]結(jié)腸癌細(xì)胞[12]、乳腺癌細(xì)胞[13]等，這些小分子多肽可能在腫瘤的早期診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲、腫瘤靶向治療等方面有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。而目前國內(nèi)外針對抗卵巢癌短肽的研究只有少數(shù)報(bào)道。王世宣等[14]利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫，對卵巢癌細(xì)胞株A2780進(jìn)行4輪生物淘洗，獲得抗腫瘤短肽YYGLAEVDAGGS。Zhang等[15]利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫，對卵巢癌細(xì)胞SKOV3進(jìn)行3輪生物淘洗，從而獲得卵巢癌細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽SVSVGMKPSPRP，推測能成為卵巢癌靶向治療的配體肽段。

本研究以上皮性卵巢癌細(xì)胞株HO-8910為靶細(xì)胞，利用噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)過3輪生物淘洗，回收率從1.5×10-6增加至4.6×10-4，第3輪的回收率與第1輪相比增加了306倍，提示陽性噬菌體得到有效的富集。在ELISA試驗(yàn)中，選取P/N值高的17個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行DNA測序，根據(jù)插入外源基因序列推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果顯示這17個(gè)噬菌體單克隆中含有9種不同噬菌體，其中展示Met-Arg-Met-Thr-Ile-Ile-Asn（MRMTIIN）序列的噬菌體有7個(gè)，出現(xiàn)頻率最高。

為進(jìn)一步鑒定篩選獲得的噬菌體MRMTIIN與細(xì)胞株HO-8910結(jié)合的特異性，本研究隨后進(jìn)行噬菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、免疫細(xì)胞染色、免疫熒光染色、競爭抑制實(shí)驗(yàn)。在噬菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，與PANC-1、SKOV3細(xì)胞株相比，噬菌體MRMTIIN與HO-8910細(xì)胞有較高的親和力和特異性。免疫細(xì)胞染色和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HO-8910細(xì)胞表面可見棕黃色顆粒（綠色熒光信號），說明噬菌體MRMTIIN能與HO-8910細(xì)胞結(jié)合，而PANC-1、SKOV3細(xì)胞表面未見棕黃色顆粒（綠色熒光信號），說明噬菌體MRMTIIN不能與PANC-1細(xì)胞及SKOV3細(xì)胞結(jié)合，免疫細(xì)胞染色和免疫熒光結(jié)果相一致。競爭抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨著合成多肽濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量逐漸減少，而含有相同氨基酸但排列順序不同的對照肽RMTIINM，隨著濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量未見明顯改變，說明合成多肽MRMTIIN能有效抑制噬菌體MRMTIIN與卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的結(jié)合。

綜上所述，利用噬菌體展示技術(shù)篩選出的卵巢癌細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽MRMTIIN能選擇性與HO-8910細(xì)胞結(jié)合，利用此多肽進(jìn)行生物體內(nèi)淘洗等實(shí)驗(yàn)，可能會成為上皮性卵巢癌早期診斷的檢測指標(biāo)。