氯硝柳胺聯合順鉑抑制腎上腺皮質癌的實驗研究*

王敏捷，王尉，朱沂，趙旭，胡衛列

（1.解放軍第422醫院 泌尿外科，廣東 湛江 524009；2.廣州軍區廣州總醫院 泌尿外科，廣東 廣州 510010）

順鉑是腎上腺皮質癌常用的化療藥物之一[1-2]，大劑量應用易誘發骨髓抑制、腎功能損害，并產生耐藥性，降低療效[3]，所以降低其劑量，增強腎上腺皮質癌對其敏感性的研究有非常重要的臨床應用價值。最新研究發現，氯硝柳胺有抗腫瘤活性，且能增強順鉑對三陰乳腺癌的毒性作用[4]。本實驗聯用氯硝柳胺和順鉑，研究其對腎上腺皮質癌的療效及作用機制，為探索腎上腺皮質癌新的治療方案提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞 人腎上腺皮質癌SW-l3細胞株（上海中國科學院細胞庫）。

1.1.2 藥物 氯硝柳胺、順鉑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 試劑 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（美國MPBIO公司），胰酶、雙抗購自美國Gibco公司，L-15培養基、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）購自上海Genom公司，兔抗人β-actin抗體、兔抗人Bcl-2抗體、Caspase-3抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白檢測試劑盒、二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）購自美國Sigma-Aldrich公司，結晶紫染液（上海碧云天生物技術公司），基質膠（美國Corning公司），CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒、吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide AO/EB）細胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自日本DOJINDO公司。

1.2 儀器與設備

8μl孔Transwell小室、流式細胞儀LSRII購自美國BD公司，培養瓶/皿、離心管購自美國Corning公司，倒置顯微鏡（日本Olympus公司），37℃無二氧化碳CO2恒溫孵箱（美國Thermo公司）。

1.3 SW-13細胞培育

SW-13細胞接種于25 cm2培養瓶，培養液為L-15培養基（含10% FBS和1%雙抗），37℃無CO2恒溫孵箱常規培養，當細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.4 SW-13細胞增殖檢測

將處于對數生長期的SW-13細胞按2×103個/孔，接種于96孔培養板，用不同濃度的氯硝柳胺（4.00、2.00、1.00、0.50和 0.25μmol/L）和順鉑（40、32、24、16、8和4 mg/L）處理細胞，每組設3個復孔。分別于藥物處理24和48 h后加入10μl CCK-8，避光37℃恒溫無CO2孵箱培養4 h，用酶標儀測定450 nm處吸光值（optical density, OD值）。然后，根據細胞對2種藥物的反應，選取0.5和1.0μmol/L氯硝柳胺與不同濃度順鉑聯合處理細胞48 h，CCK-8法檢測OD值。實驗重復3次。根據OD值計算細胞生存率、半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）并繪制細胞生存率曲線。細胞生存率（%）=（OD實驗組-OD空白組）／（OD陰性組-OD空白組）×100%。

1.5 SW-13細胞凋亡檢測

1.5.1 Annexin V/PI染色 將SW-13細胞接種于25 cm2培養瓶，設對照組、氯硝柳胺組（1μmol/L氯硝柳胺）、順鉑組（16 mg/L順鉑）、聯合用藥組（1μmol/L氯硝柳胺＋16 mg/L順鉑），過夜培養后用藥物處理。48 h后按Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.5.2 AO/EB染色 將SW-13細胞按5×105個/孔接種于6孔板。分組同1.5.1，過夜培養后進行藥物處理。48 h后按照AO/EB凋亡染色試劑盒說明書進行染色，熒光顯微鏡下隨機選取5個視野觀察結果、拍照，并且計數正常、早期、晚期凋亡細胞數，取平均值，根據結果計算凋亡率。實驗重復3次。

1.6 Transwell實驗

將 SW-13細胞按 1×104個 /室接種于 8μl孔Transwell小室的上室，分組同1.5.1。下室加入500μl含30% FBS的L-15培養基，過夜培養后按分組藥物處理，24 h后用0.1%結晶紫室溫下染色5～10 min，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察結果，并拍照、計數，計算細胞侵襲力。實驗重復3次。

1.7 細胞劃痕實驗

將SW-13細胞接種于6孔板，密度掌握為過夜培育后板底無空隙，分組同1.5.1。過夜培養后用100μl槍頭垂直于底壁，力量均勻劃痕3～5道。用PBS洗去脫落細胞和細胞碎片，藥物處理后24 h顯微鏡下拍照。實驗重復3次。根據細胞間距計算遷移率，細胞遷移率=（1-愈合后間距/起始間距）×100%。

1.8 Western blot檢測

將SW-13細胞接種于25 cm2培養瓶，分組同1.5.1。過夜培養后進行藥物處理，48 h后按BCA蛋白檢測試劑盒說明書進行操作，結果條帶用Image-Pro軟件分析灰度值，β-actin作為內參蛋白。實驗重復3次。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 15.0統計軟件和Graphpad Prism 5.0作圖軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯硝柳胺和順鉑抑制SW-13細胞的增殖

2.1.1 氯硝柳胺 氯硝柳胺各濃度處理組24和48 h細胞存活率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞存活率有差別（F=114.614，P=0.000）；②各濃度處理組細胞生存率有差別（F=293.883，P=0.000），隨藥物濃度的升高對SW-13細胞增殖的抑制作用越強；③各濃度處理組的細胞生存率變化趨勢有差別（F=4.841，P=0.02）。氯硝柳胺24和48 h的IC50為1.825和1.250μmol/L。見圖1。

2.1.2 順鉑 順鉑各濃度處理組24和48 h細胞存活率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞存活率有差別（F=2135.204，P=0.000）；②各濃度處理組細胞生存率有差別（F=137.885，P=0.000），隨藥物濃度的升高對SW-13細胞增殖的抑制作用越強；③各濃度處理組的細胞生存率變化趨勢有差別（F=159.979，P=0.000）。順鉑24和48 h的IC50為43.94和25.97 mg/L見圖2。

2.2 氯硝柳胺增強順鉑對SW-13細胞增殖的抑制作用

順鉑組、順鉑+0.5μmol/L氯硝柳胺組、順鉑+1.0μmol/L氯硝柳胺組在4、8、16、24、32和40 mg/L順鉑中48 h細胞存活率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同濃度順鉑的細胞存活率有差別（F=1072.297，P=0.000），②各組細胞生存率有差別（F=201.336，P=0.000），③各組的細胞生存率變化趨勢有差別（F=37.443，P=0.000）。氯硝柳胺可以增強順鉑對SW-13的毒性作用，且隨著氯硝柳胺濃度的升高毒性作用越強。見圖3。

圖2 不同劑量順鉑對SW-13細胞增殖的影響 （±s）

圖3 氯硝柳胺增強順鉑對SW-13細胞增殖的抑制作用（±s）

2.3 氯硝柳胺聯合低劑量順鉑促進SW13細胞凋亡

Annexin V/PI染色流式細胞儀檢測早期凋亡細胞位于右下象限，晚期凋亡細胞位于右上象限（見圖4）。48 h對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯合用藥組細胞總凋亡率分別為（5.1±3.9）%、（28.5±6.01）%、（26.89±5.11）%和（50.53±9.87）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=12.354，P=0.007）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的細胞總凋亡率比較，差異有統計學意義（t=3.797和6.031，P=0.019和0.004），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組低（見圖5）。

圖4 各組SW-13細胞的凋亡

2.4 各組SW-13細胞凋亡的形態學特征

AO/EB染色后熒光顯微鏡下正常SW-13細胞呈毛玻璃樣，均勻染綠色；早期凋亡細胞胞質、胞核呈綠色，但胞核固縮呈圓珠狀；晚期凋亡細胞呈桔紅色，胞核固縮呈圓珠狀（見圖6）。48 h對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯合用藥組的細胞總凋亡率分別為（5.8±4.2）%、（28.1±5.03）%、（27.1±4.98）%和（54.5±8.12）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=22.602，P=0.000）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的細胞總凋亡率比較，差異有統計學意義（t=5.525和6.180，P=0.001和0.000），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組低（見圖7）。

圖5 各組SW-13細胞總凋亡率比較 （±s）

圖6 各組SW-13細胞凋亡的形態學特征 （AO/EB染色×100）

2.5 氯硝柳胺聯合低劑量順鉑降低SW-13細胞侵襲能力

Transwell實驗結果顯示，藥物處理24 h后，對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯合用藥組隨機5個視野平均細胞數分別為（63.5±9.1）、（20.6±8.0）、（22.2±7.8）和（9.4±3.6）個，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=5.341，P=0.022）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的平均細胞數比較，差異有統計學意義（t=2.870和3.338，P=0.021和0.010），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組高。見圖8、9。

圖7 各組SW-13細胞總凋亡率比較 （±s）

圖8 各組藥物作用24 h后SW-13細胞的侵襲能力 （結晶紫染色×100）

圖9 各組藥物作用24 h后SW-13侵襲細胞數比較 （±s）

2.6 氯硝柳胺聯合低劑量順鉑降低SW-13細胞遷移能力

細胞劃痕實驗結果顯示，藥物處理24 h后，對照組、氯硝柳胺、順鉑組、聯合用藥組遷移率分別為（43.25±5.48）%、（16.65±3.26）%、（17.74±3.13）%和（8.81±1.25）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=9.715，P=0.013）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的遷移率比較，差異有統計學意義（t=3.226和4.589，P=0.031和0.010），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組高。見圖10、11。

2.7 氯硝柳胺聯合低劑量順鉑抑制Bcl-2的表達，促進Caspase-3的表達

2.7.1 Bcl-2 Western blot檢測結果顯示，對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯合用藥組的Bcl-2相對表達量分別為（87.91±8.89）、（75.98±9.26）、（71.73±6.77）和（24.82±9.13），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=33.716，P=0.001）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的Bcl-2相對表達量比較，差異有統計學意義（t=6.811和7.143，均P=0.002），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組高。見圖12、13。

圖10 各組SW-13細胞的遷移能力 （×100）

圖11 各組SW-13細胞遷移率比較 （±s）

圖12 各組Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達

2.7.2 Caspase-3 Western blot檢測結果顯示，對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯合用藥組的Caspase-3相對表達量分別為（15.48±5.14）、（27.52±3.26）、（35.74±5.08）和（64.52±5.09），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=54.406，P=0.000）。進一步兩組、氯硝柳胺、順鉑組、聯合用藥組的E-cadherin相對表達量分別為（18.58±6.01）、（9.32±2.15）、（9.72±1.78）和（3.84±0.513），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=12.131，P=0.008）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的E-cadherin相對表達量比較，差異有統計學意義（t=4.846和5.387，P=0.008和0.006），氯硝兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的Caspase-3相對表達量比較，差異有統計學意義（t=10.593和6.929，P=0.000和0.002），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組低。見圖12、14。

2.8 氯硝柳胺聯合低劑量順鉑促進E-cadherin的表達，抑制Vimentin的表達

2.8.1 E-cadherin Western blot檢測結果顯示，對照柳胺組、順鉑組較聯合用藥組高。見圖15、16。

圖13 各組Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s）

圖14 各組Caspase-3蛋白表達水平比較 （±s）

2.8.2 Vimentin Western blot檢測結果顯示，對照組、氯硝柳胺、順鉑組、聯合用藥組的Vimentin相對表達量分別為（13.48±2.14）、（19.42±5.27）、（26.64±2.83）和（38.25±8.08），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=54.406，P=0.000）。進一步兩兩比較經Dunnett-t檢驗，氯硝柳胺組、順鉑組與聯合用藥組的Vimentin相對表達量比較，差異有統計學意義（t=5.514和4.304，P=0.005和0.013），氯硝柳胺組、順鉑組較聯合用藥組低。見圖15、17。

圖15 各組E-cadherin、Vimentin蛋白的表達

圖16 各組E-cadherin蛋白表達水平比較 （±s）

圖17 各組Vimentin蛋白表達水平比較 （±s）

3 討論

腎上腺皮質癌是一種起源于腎上腺皮質的惡性腫瘤，病程進展迅速。該病早期診斷困難，導致大多數患者確診時已屬晚期，治療仍以根治手術為主[5]。由于缺乏有效的輔助治療手段，使該病預后極差，病死率達40%[6]。因此，為有效提高腎上腺皮質癌患者的生存率，手術聯合藥物治療是一項重要的研究課題。

順鉑是臨床治療腎上腺皮質癌依托泊甘+順鉑+表柔比星+米托坦方案的重要成分，但大劑量順鉑誘發的骨髓抑制、腎功能損害等副作用嚴重影響其臨床應用，而且隨著順鉑劑量的增大，能夠明顯增加其耐藥率[7]，所以降低順鉑的劑量，增強腎上腺皮質癌細胞對順鉑敏感性的研究有非常重要的臨床應用價值。

在細胞增殖實驗中發現，氯硝柳胺和不同濃度的順鉑聯合作用于SW-13細胞后，可以提高順鉑對SW-13細胞的毒性作用，對低劑量順鉑的殺傷作用促進尤為明顯。在凋亡實驗中發現，氯硝柳胺增強低劑量順鉑抑制SW-13細胞的增殖作用與促進細胞凋亡相關，聯合用藥組細胞凋亡率達50.53%，較氯硝柳胺和順鉑組的28.5%和26.89%提高。AO/EB凋亡實驗中不僅進一步證實該促凋亡作用，而且能直觀地觀察細胞凋亡的形態學變化。在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起至關重要的作用。Bcl-2是細胞凋亡的負調節因子，受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡[8]，而活化的Caspase-3是啟動細胞凋亡的標志。Western blot檢測結果顯示，聯合用藥組的Bcl-2蛋白表達水平較氯硝柳胺組、順鉑組明顯抑制，而Caspase-3表達較氯硝柳胺組、順鉑組升高。說明氯硝柳胺聯合低劑量順鉑有可能是通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和促進凋亡啟動蛋白Caspase-3的表達，來發揮促進細胞凋亡的作用，并通過促進凋亡，抑制SW-13細胞的增殖。通過Transwell實驗和細胞劃痕實驗證實，氯硝柳胺和順鉑聯合應用可以降低SW-13細胞的侵襲和遷移能力，聯合用藥組較氯硝柳胺組、順鉑組對SW-13細胞侵襲和遷移能力的抑制作用更明顯。研究發現，上皮間質轉化參與多種腫瘤的浸潤、轉移，是腫瘤侵襲、轉移的一個重要分子機制[9]。腫瘤細胞E-cadherin的缺失是促進腫瘤轉移的重要表現[10]，隨著E-cadherin表達減少，Vimentin蛋白表達增加，腫瘤惡性程度增加[11]。通過Western blot檢測發現，聯合用藥組較氯硝柳胺組、順鉑組可以明顯抑制Vimentin的表達，促進E-cadherin的表達，表明氯硝柳胺和低劑量順鉑聯合應用有可能是通過對上皮間質轉化相關蛋白表達的影響，降低SW-13細胞的侵襲和遷移能力。

細胞的增殖和凋亡都是多基因調控的復雜過程。研究發現，氯硝柳胺可以通過抑制Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB、Notch、HEDGEHOG 等信號通路，發揮抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用[12-14]。已知外在的死亡受體通路或內在的線粒體通路都可以促進順鉑誘導的細胞凋亡，在此過程中有多種蛋白質參與，如JNK信號通路蛋白、p53、抗凋亡蛋白及Bcl-2家族蛋白[15]。因此，氯硝柳胺與順鉑聯用的抗腫瘤機制是相當復雜的過程，仍需進一步實驗證明。

綜上所述，本研究在體外聯合氯硝柳胺和低劑量順鉑作用于SW-13細胞，通過對其細胞增殖、凋亡，以及細胞侵襲力和遷移能力的多角度觀察，認為氯硝柳胺和低劑量順鉑聯合應用可以抑制SW-13細胞增殖，促進細胞凋亡，降低其侵襲和遷移能力。并且這種抑制增殖和促進凋亡作用是通過抑制Bcl-2的表達，促進Caspase-3的表達實現的，同時氯硝柳胺和低劑量順鉑聯合應用通過對Vimentin和E-cadherin的表達影響，降低SW-13細胞的侵襲和遷移能力。希望通過本研究可以對腎上腺皮質癌的治療提供理論支持，在提高順鉑的抗腫瘤作用的同時，降低由于大劑量應用順鉑而造成的副作用和細胞耐藥。