骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調控通路研究綜述

楊小月，陳建明，劉小龍，張 娟，林家仕

(集美大學體育學院，福建 廈門361021)

運動作為一種生理刺激，會導致骨骼肌內部物質發生適應性改變，如線粒體生物合成和血管增生等。大量的研究表明過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1a(Peroxisome proliferators-activated reptorγ coactivator-1a，PGC-1a)是調控線粒體生物合成的核心因子，對其上下游調控因子的研究也比較成熟。上游主要調控因子為腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[1]、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)[2]、鈣調蛋白激酶II(CaMKII)[3]等；下游主要調控因子為核呼吸因子1(NRF1)、核呼吸因子2(NRF2)等[4]。線粒體生物合成依賴血管為其提供氧氣和能源物質，但是目前對骨骼肌血管合成的研究相對較少，尤其是與VEGF相關的具體通路方面。近年來，大量流行病學調查和干預性研究表明，心肺耐力 (cardiorespiratory fitness,CRF)是預測心血管和代謝性疾病風險(血壓、血脂、 血糖、肥胖)的獨立因素，CRF水平越高越有利于降低疾病風險[6]。由于骨骼肌血管合成對CRF的提高具有重要作用，因此，研究運動誘導骨骼肌血管合成適應將有可能成為揭示高水平的CRF改善代謝性疾病風險因素這一重要理論的關鍵突破口。大量文獻普遍認為VEGF是促進骨骼肌血管合成的核心的因子，但卻未見其相關的調控通路研究的文獻綜述。為此，本文對四條主要通過VEGF調控骨骼肌血管合成的通路的研究成果進行綜述，旨在為后來研究者提供理論依據和研究思路。

1 VEGF與骨骼肌血管合成

參與骨骼肌血管合成因子很多，如成纖維細胞生長因子2(FGF-2)，它是一種強烈的分裂素，作用于內皮細胞、平滑肌細胞和纖維母細胞，可以上調VEGF和一氧化氮(NO)產物[7,8,9]。其他參與血管合成的細胞因子包括血小板源性生長因子和轉化生長因子、基質金屬蛋白酶類、血纖維蛋白溶酶原、尿激酶、組織纖溶酶原激活物等。這些因子無故溶解將導致結構完整性消失，微血管功能也將喪失，最終將影響骨骼肌血管合成[10]。

血管合成被多條促血管新生因子所調控，同時也被調節毛細血管生成和復原的因子所調控[11，12]。在骨骼肌中，維持血管生成和毛細血管生長的最重要因子是VEGF[13，14，15]，被認為是調控骨骼肌血管合成的核心因子。目前我們知道VEGF和其他促血管生長因子過程最初來源于鑒定抽芽式血管合成實驗，而且主要是在骨骼肌中進行[16]。肌肉收縮時，儲存于囊泡中的VEGF被分泌至小間隙[17]，作用于血管內皮細胞的VEGF受體，通過與其受體VEGFR2結合促進骨骼肌血管合成[18]。也有研究表明，當VEGF濃度較低時，骨骼肌中毛細血管與纖維比率將下降[19,20]。所以VEGF與其受體對骨骼肌血管合成作用突出。

2 不同運動方式與VEGF表達

不同運動方式可上調骨骼肌中的VEGFmRNA和蛋白表達。運動方式可分為一次急性運動和長期運動。一次急性運動包括間歇訓練(HIT)[21]、持續性訓練(CONT)[22]以及抗阻訓練(RE)[23]等；長期運動干預包括到日常體力活動[24]和有氧訓練[25]等。1996年，Breen EC等對老鼠肌肉刺激模擬肌肉運動即刻后，VEGF mRNA上調了2～4倍，在隨后的4 h也有所增加，8 h后恢復到安靜狀態下水平，同時VEGF蛋白增加和其mRNA增加一致[26]。2008年，Riikka Kivel?等對48只老鼠進行一次性跑臺運動實驗，運動后6小時，VEGF-A及其受體VEGFR-2mRNA分別增加了25 %和29 %，VEGF-B增加了15%(P=0.05)(如圖1)，表明一次性運動可有效促進老鼠骨骼肌VEGF mRNA表達[27]。2014年，Patrick Wahl等對12名受試者進行三種運動方案，試驗分別是130 min 55 %最大輸出功率(PPO)、4x4min95%PPO和4x30s 全力(all-out)，發現三種運動后VEGF mRNA明顯上升，在運動后30分期間逐漸減少至運動前水平，表明運動均可上調VEGF(如圖2)，但是該實驗并沒有控制運動時間變量[28]。2016年，Conor W.Taylor等控制運動時間對8名運動員進行HIT(4x30s最大沖刺，間歇4min)和CON(120 s最大沖刺)實驗，運動3小時后發現VEGF mRNA顯著升高，分別提高了3.5倍和4.3倍(P=0.02)(如圖3)，表明運動方式對VEGF mRNA表達影響甚大[29]。

圖1 一次性運動對VEGF mRNA和其受體表達示意圖(引自Kivel? R，2008)

上述對運動方式的分析中，發現不同運動方式、運動強度、運動時間、受試對象等的差異，造成運動后VEGF提高的幅度不一樣。目前，大多研究表明HIIT比CON運動方式對人體的生理刺激更大，運動后VEGF提高的幅度應該更大，然而Conor W.Taylor等的研究出現相反的結果：CON(120s最大沖刺)比HIIT(4x30s最大沖刺，間歇4min)提高VEGF mRNA的幅度更大(～4.3 VS ～3.5倍,P = 0.02)。經過比較兩種運動方案分析得出，可能是HIIT的間歇時間過長，雖然控制了運動的時間，但整個運動方案總時間不相等，后者明顯比前者時間更長，這可能是造成HIIT提高VEGF的幅度不如CON的主要原因。另外，骨骼肌能量攝取速率具有強度依賴性，尤其在以有氧代謝為主的運動中，強度對加速骨骼肌血管合成速度起至關重要的作用[30]。因此，不同運動強度下，信號傳導通路中關鍵節點酶的活性必然會隨強度變化而變化，從而造成VEGF提高的幅度差異。人體實驗和動物實驗的受試對象也存在較大差異，人體實驗受試者的心理和生活條件控制相對較難，而動物大多生活在統一飼養的動物房，生活條件容易把控。不同的運動方式均可上調VEGF mRNA和蛋白，但是其中的調節通路尚不清楚，因此研究運動對骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調控通路意義重大。

3 運動對骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調控通路

運動對骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調控通路主要分兩大組，即促進組和抑制組。促進組包含運動通過PGC-1家族( PGC-1s)和低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)調控通路；抑制組包含運動通過凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)和金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)調控通路。

3.1 運動通過PGC-1s調控骨骼肌血管合成

PGC-1s調控不同組織的代謝功能[31]，其家族由PGC-1a、PGC-1β和PRC組成。這三個轉錄調控者自身沒有調控活性，但是可以結合DNA轉錄因子促進線粒體生物合成、脂肪酸氧化、控制糖異生、血管生成等[32]。

PGC-1s在調控運動促進骨骼肌血管合成中發揮重要作用。2008年，Zoltan Arany等提出PGC-1a誘導雌激素相關受體a(ERRa)促進VEGF表達，從而增強老鼠骨骼肌的血管合成，并且指出該通路與低氧誘導HIF-1通路獨立。文中引出了原本控制線粒體生物合成的因子PGC-1a和ERRa也參與血管合成的表達，但是并沒有通過實驗完全證明兩者與VEGF絕對相關[33]。直到2009年，Chinsomboon J等通過實驗證明了PGC-1a和ERRa與VEGF具有正相關性，并且首次較為完整地提出了運動促進骨骼肌血管合成的通路，即β腎上腺素-PGC-1a-ERRa-VEGF軸。通過分別給老鼠注入生理鹽水(10mg/kg)和propranolol (10mg/kg，一種腎上腺素受體抑制劑)，16小時自由運動后發現注入生理鹽水組的老鼠股四頭肌的PGC-1a和VEGF表達被強烈誘導，相反注入propranolol老鼠組被明顯抑制，證明了β腎上腺素調節運動誘導的PGC-1a和VEGF(如圖4)。為了繼續觀察PGC-1a是否調節腎上腺素對VEGF的誘導，給PGC-1a敲除的和野生型老鼠注入clenbuterol(一種腎上腺素受體激動劑)，6h后取股四頭肌發現clenbuterol使野生型老鼠的VEGF表達增加了～2.5倍(p<0.05)，而敲除PGC-1a組的VEGF沒有被誘導，證明了β腎上腺素調節運動誘導VEGF表達需通過PGC-1a(如圖5)。通過敲除ERRα實驗證明了PGC-1a調控VEGF需通過ERRa(如圖6)[34]。此后2011年，Rowe GC等提出PGC-1β(PGC-1β被確定為PGC-1a的同源體[35]，N端激活區域的40%和C端RNA結合區域的48%，許多功能與PGC-1a相似，包括線粒體程序的激活[36])，通過誘導VEGF表達以促進骨骼肌血管合成，這個過程中需要ERRa的參與，并且獨立于HIF-1調控途徑。在聯合實驗中，骨骼肌細胞PGC-1β過表達依賴VEGF，可增加鄰近內皮細胞的遷移和骨骼肌血管密度，豐富了PGC-1s調控骨骼肌血管合成的體系，同時從側面證明了PGC-1s對骨骼肌血管合成的關系非常密切。

圖6 敲除ERRa后運動對VEGF的影響示意圖

值得一提的是，PGC-1a亞基可精確調控運動對骨骼肌血管合成的途徑。2014年，Thom R等對PGC-1a的兩個特殊亞基進行研究指出：編碼PGC-1a的特殊結構為NT-PGC-1a和PGC-1a4，前者強烈地誘導VEGF表達，促進內皮細胞遷移和肌管形成，從而使骨骼肌血管增加，然而對線粒體基因沒有影響；后者轉基因表達也可誘導骨骼肌血管合成。并且通過敲除NT-PGC-1a和PGC-1a4以及HIF-1a后，VEGF對低氧沒有反應，表明以上兩個亞基參與了PGC-1a調控的骨骼肌低氧反應[36]。但是并沒有說明運動也是通過NT-PGC-1a和PGC-1a4兩個亞基發揮調控作用，因為PGC-1a亞基包括PGC-1a-a、PGC-1a-b、PGC-1a-c、NT-PGC-1a、PGC-1a4。運動到底通過以上亞基的兩種或幾種促進血管合成，我們尚不清楚；此外，哪種強度對骨骼肌血管合成影響最大，是強度越大合成速率就越大的正相關性關系？還是中等強度越大，隨后逐漸減少？我們不得而知，還有待今后進一步研究。

3.2 運動通過HIF-1調控骨骼肌血管合成

HIF-1有兩種亞基其中HIF-1a被認為是分子氧氣感應器。當氧氣充足時，持續合成的蛋白會被降解，但是當氧氣不足時，HIF-1a就會被堆積。此外，HIF-1的另一種亞基是HIF-1β，可結合HIF-1a形成HIF-1，具有消炎、血管合成、脂肪合成、細胞內外基質重塑等功能[37]。

目前缺血和缺氧均可激活PGC-1a和HIF-1表達，從而促進骨骼肌血管合成。運動通過PGC-1a可促進血管合成，但是運動是否通過HIF-1也有如此作用？2004年，Mason SD等通過敲除HIF-1a后，發現老鼠的運動時間相比野生型低，從糖酵解供能到有氧供能時間延長，而且重復運動使敲除老鼠組肌肉損害[38]。這種現象在人體中也觀察到，表明HIF-1在肌肉供能的代謝控制中具有重要作用。2008年Zoltan Arany等研究報道缺氧激活了HIF-1a和HIF-2a以促進VEGF表達，從而促進血管合成[33]。而且通過敲除PGC-1a或敲除HIF-1亞基實驗證明了該途徑不經過PGC-1a。從缺氧狀態下表明，PGC-1a和HIF-1a為兩條不同促進骨骼肌血管合成的通路，但是在運動狀態下是否通過HIF-1a調控骨骼肌血管合成？2014年，Paula Rodriguez-Miguelez等通過對24只老鼠進行離心運動實驗，發現離心運動促進沒經過訓練的骨骼肌HIF-1a和VEGF表達增加，但是長期運動后此表達程度減緩[39]。證明了HIF-1a確實參與運動促進骨骼肌血管合成中，還指出VEGF通過激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS)產生NO，而NO又促進HIF-1a表達，最終增強VEGF表達，形成一個正反饋調控環。從文中可以總結出短暫的運動可以促進HIF-1a和VEGF等促血管合成因子的表達，而且提出NO參與調控過程的看法，但是沒有證明其通路的順序，是運動激活eNOS產生NO，調控HIF-1a和VEGF，最終促進骨骼肌血管合成？還是運動先促進HIF-1a和VEGF表達，VEGF激活eNOS產生NO，從而再回頭促進前者基因表達從而增強骨骼肌血管合成？其中的通路我們尚不清楚。

3.3 運動通過TSP-1和TIMP-1抑制VEGF表達

TSP-1是一種基質細胞糖蛋白，首次在激活的血小板中發現，是TSP家族中研究最多的蛋白。TSP家族有五種蛋白：TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5，其中TSP-1和TSP-2結構相似。很多正常細胞分泌TSP-1，如內皮細胞、纖維母細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞和轉化細胞(惡心膠質瘤細胞)。研究表明，TSP-1對于毛細血管生成調節很重要，被認為可抑制血管生成[40]。敲除TSP-1的老鼠，血管生成相比野生型老鼠更高，表明TSP-1抑制血管生成。而TIMP-1，一種血管生成復合物，對骨骼肌的毛細血管合成調節也相當重要，其發生機制可能是通過矩形金屬蛋白(MMPs)以促進細胞外基質的退化，進而間接限制毛細血管生長。也有研究顯示，TIMP-1表達對肌肉活動很敏感，短暫的運動將增加TIMP-1mRNA濃度，從而抑制VEGF表達[41]。

4 小結

綜上所述，運動主要通過四條通路調控骨骼肌血管合成：PGC-1a-VEGF通路、HIF-1a-VEGF通路、TSP-1-VEGF通路和TIMP-1-VEGF通路。其中PGC-1a-VEGF通路尤為重要，可能影響其他三條通路的調控作用。若需解決上述關于是否存在起主導作用的信號通路的問題，則需要從較高層次或全新的視角提出幾點假說：1)VEGF表達雖是上述四條信號轉導通路共同作用的結果，但仍存在著起主導作用的信號轉導通路；2) 從動態的劑量(效應理論角度分析運動促進骨骼肌血管合成中重要的調控因子之間的相互作用也許大有裨益；3)運動對信號通路網絡的激活應該是全面的，VEGF一定存在著對變量(運動強度和時間)大小的最佳范圍。