太子參均一多糖HPLC—FLD檢測方法的建立

栗園 楊斌 闞永軍 胡娟 龐文生

【摘 要】 目的：建立一種太子參均一多糖的高效液相色譜-熒光檢測方法（HPLC-FLD）。方法：用異硫氰酸熒光素（FITC）標記太子參均一多糖，采用HPLC-FLD，考察不同溶劑、流動相、色譜柱對檢測結果的影響，確定最佳檢測條件，建立太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測方法。結果：熒光檢測激發波長為490nm，發射波長為518nm；大連依利特Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；樣品溶于30%乙腈，乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀（30∶[KG-*3/5]70）為流動相；確定HPLC-FLD檢測熒光多糖最佳條件。結論：該方法準確、有效，可用于檢測太子參熒光均一多糖，為太子參多糖在體內外吸收特征和活性研究奠定基礎。

【關鍵詞】 太子參均一多糖；HPLC-FLD；檢測方法

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）02-0021-05

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效[1]，其多糖有顯著的降血糖作用，且能降低血脂水平，改善脂質代謝紊亂[2]。課題組前期利用水提醇沉法得到太子參粗多糖，采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠色譜柱對太子參粗多糖進行分離純化得到均一多糖[3-6]。為了進一步考察均一多糖的活性，建立靈敏、特異性強的檢測方法，是監測均一多糖細胞體外/動物體內吸收、代謝特征的關鍵。

目前檢測多糖的方法有分光光度法、柱前衍生-高效液相色譜法、酶聯免疫法、電化學法。傳統苯酚硫酸分光光度檢測法粗糙、靈敏度低；酶分析法或電化學法雖然檢測靈敏度高，但受到特異性及樣品中污染物干擾的限制；色譜法能夠準確、靈敏地對多糖進行定性定量的分析，因此在多糖的分析中占有非常重要的地位；而柱前衍生-高效液相色譜法，是將樣品水解后測定單糖組成，無法考察多糖分子的整體行為[7-8]。

對糖類物質而言，其化學結構中不含生色團，不產生紫外光吸收；多數不產生熒光，無法實現直接進行紫外或熒光檢測。因此，筆者對太子參均一多糖進行熒光標記，建立一種太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測方法，以期為太子參多糖在細胞或體內吸收和活性研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 MOKULYOD-230型冷凍干燥器；3001多功能酶標儀（Thermo Fisher 公司）；HL-2D定時數顯恒流泵；DBS-100自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；AE240S分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Waters e2695液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測器（Waters 公司）；HiTrapTM Desalying分離柱（5mL，5×5mL）；Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5Lμm）色譜柱。

1.2 材料 太子參樣品于2016年7月購于福建柘參種業有限公司，經福建省中醫藥研究院闞永軍實習研究員鑒定為石竹科孩兒參的干燥塊根；葡聚糖標準品購于福州天美化工儀器設備有限公司（Pharmacia17-0320-01）；異硫氰酸熒光素（FITC，批號：SLBH5922V，Sigma 公司）；Celluose DE-52（批號：1030A024，Whatman 公司）；Sephacryl S-300HR（批號：20140117，GE 公司）；氰基硼氫化鈉（批號：1605027，aladdin 公司）；甲醇（批號：20080418）、DMSO（批號：20130711）、乙酸（批號：20160425）、硝酸鈉（批號：20151225）等購自國藥化工；無水乙醇（批號：16010902，西隴化工有限公司）。

2 方法與結果

2.1 太子參均一多糖的熒光標記 取一定量太子參均一多糖，溶于DMSO，依次加入100μL氰基硼氫化鈉溶液，100μL酪胺溶液，50μL冰醋酸，補充DMSO到2mL，多糖∶[KG-*3/5]氰基硼氫化鈉∶[KG-*3/5]酪胺的質量比為2∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]2，60℃反應4h；離心，上清液過HiTrapTM Desalying柱，用水洗脫，酶標儀280nm檢測，收集第一個峰，凍干得多糖-Tyr。

取一定量的多糖-Tyr，加入pH=8.5的0.5mol/L NaHCO3 1.5mL，加入過量FITC，避光反應過夜；反應物中加入無水乙醇至終濃度為80%，離心，沉淀加水復溶，乙醇再沉淀，重復3次，得多糖-Tyr-FITC；HiTrapTM Desalying柱純化，酶標儀490～518nm檢測，收集第一個峰，凍干即得。

2.2 熒光多糖的HPLC-FLD檢測條件考察

2.2.1 檢測波長的確立 準確稱取一定量的FITC，用30%乙腈溶解，酶標儀分別固定激發波長和發射波長來確立最佳檢測波長，結果見表1。當固定激發波長時，發射波長在518nm時有最大吸光度；固定發射波長時，激發波長在490nm時有最大吸光度。因此，確立熒光檢測激發波長（λx）為490nm、發射波長（λm）為518nm。

2.2.2 樣品溶劑的選擇 采用不同溶劑溶解FITC，相同色譜條件下分析，結果如圖1所示。采用水、0.01mol/L磷酸二氫鉀、25%甲醇作為溶劑，均不能檢出FITC色譜峰；以30%乙腈作為溶劑，FITC可得單一對稱峰。因此確定30%乙腈作為樣品溶劑。

2.2.3 流動相的選擇 分別為甲醇-水（25∶[KG-*3/5]75）、甲醇-氨水（60∶[KG-*3/5]40）、乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀（30∶[KG-*3/5]70）作為流動相，其余色譜條件相同下檢測，結果如圖2所示。以甲醇-水（25∶[KG-*3/5]75）、甲醇-氨水（60∶[KG-*3/5]40）為流動相時，FITC均不能被檢出；以乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀（30∶[KG-*3/5]70）為流動相時，FITC可得單一對稱峰。因此，確定乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀（30∶[KG-*3/5]70）為流動相。

2.2.4 色譜柱的選擇 以色譜柱為考察因素，考察Waters Ultrahydrogel TM 500 （7.8×300mm）、大連依利特Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，在相同色譜條件下分析，結果如圖3所示。用Waters Ultrahydrogel TM 500（7.8×300mm）色譜柱時，FITC不能出峰；用大連依利特Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱時，FITC可得單一對稱峰。因此，確定大連依利特Hypersil BDS C18 （4.6mm×250mm，5μm）為本實驗的色譜柱。

綜上，本研究所建立方法的最佳色譜條件為：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀（30∶[KG-*3/5]70）流動相；流速0.5 mL/min；柱溫35℃；進樣量20 μL；檢測激發波長為490 nm，發射波長為518 nm；樣品溶劑為30%的乙腈。

2.3 熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測

2.3.1 標準曲線的建立 精密稱取分子量為40000Da熒光葡聚糖標準品0.25、0.5、1、2、4mg，30%的乙腈定容至10mL，得濃度為25、50、100、200、400μg/mL的標準溶液，按“2.2.4項”下的色譜條件檢測，以濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積（伏·秒）為縱坐標，得線性回歸方程Y=0.073x + 0.310，相關系數r=0.9989。

2.3.2 樣品分析 準確稱取300μg太子參熒光均一多糖，30%的乙腈定容至1mL，濃度為300μg/mL，以同樣的方法配制FITC溶液，按“2.2.4項”下的色譜條件檢測。結果如圖4所示。

結果表明，在該條件下未標記均一多糖未檢測到色譜峰，FITC色譜峰保留時間為36.58min，熒光均一多糖保留時間為4.25min，峰面積為13.75伏·秒，代入回歸方程，得出太子參熒光均一多糖以熒光葡聚糖（分子量40000Da）計濃度為184.1μg/mL。

3 討論

3.1 溶液選擇 對太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD的檢測條件考察過程中，發現熒光多糖在有乙腈存在的體系中容易被檢測到，因此樣品溶劑和流動相中都含有乙腈；多糖在乙腈中的溶解度與分子量成反比，所以本實驗樣品溶劑和流動相中均含有30%的乙腈。

3.2 對照品選擇 本實驗所用太子參熒光均一多糖的分子量在50000Da左右，由于沒有太子參熒光多糖的對照品，因此選擇結構相似、分子量相近40000Da的熒光葡聚糖標準品作為對照品，所以本實驗是以熒光葡聚糖表示太子參熒光均一多糖的測定結果。

3.3 檢測方法建立 對糖類物質而言，其化學結構中不含生色團，不產生紫外光吸收；多數不產生熒光，無法實現直接紫外或熒光檢測。本文采用FITC對太子參均一多糖進行熒光標記后，實現高效液相色譜熒光檢測器檢測；所建立的檢測方法檢測限低、受雜質干擾較小，可為今后研究太子參多糖在體內外的吸收特征、藥效分子機制等提供技術支撐。

綜上，筆者將一種太子參均一多糖成功地進行了熒光標記。以490nm為激發波長、發射波長518nm，大連依利特Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm/5μm）色譜柱，30%的乙腈為樣品溶劑，乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀（30∶[KG-*3/5]70）為流動相，建立太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測方法。該方法準確、有效，可為太子參多糖在體內外吸收特征和活性研究奠定基礎。

參考文獻

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