金蛭方對缺血性中風大鼠血清及腦組織IL—1β、TNF—α的影響

吳翟 王彩榮 張靈敏 楊建新 周恒 王麗

【摘 要】 目的：通過觀察金蛭方對缺血性中風大鼠白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響，探討其治療缺血性中風的作用機制。方法：采用線栓法復制缺血性中風大鼠模型，隨機分為假手術組、模型對照組、金蛭方高劑量組、金蛭方低劑量組、陽性藥尼莫地平片對照組。測定大鼠血清和腦組織IL-1β、TNF-α的含量。結果：與假手術組比較，缺血性中風大鼠血清及腦組織IL-1β、TNF-α的含量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各治療組均能降低IL-1β、TNF-α的含量（P<0.01）。結論：金蛭方通過調節缺血性中風大鼠IL-1β、TNF-α的分泌和釋放以達到拮抗缺血性中風作用。

【關鍵詞】 金蛭方；缺血性中風；白介素-1β；腫瘤壞死因子-α

【中圖分類號】R-332 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）02-0042-03

Abstract：Objective To explore the effects of the Jinzhif，Prescription on ischemic stroke rat interleukin - 1 beta （IL-1）， the effect of the expression of tumor necrosis factor alpha （TNF alpha）， and to explore its mechanism in the treatment of ischemic stroke. Methods Using the suture method to copy the rat model of ischemic stroke were randomly divided into sham operation group， model control group， the Jinzhi Prescription high dose group， the Jinzhi Prescription low dose group， positive drug nimodipine tablets in the control group. The contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats were determined. Results Compared with sham operation group， the contents of IL-1 and TNF-α in serum and brain tissue of rats with ischemic stroke were significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the treatment group could decrease the content of IL-1 and TNFα- （P<0.01）. Conclusion The Jinzhi Prescription through regulation of ischemic stroke rat IL-1， TNF -α secretion and release in order to achieve the antagonistic effect of ischemic apoplexy.

Keywords：Jinzhi Prescription； Lschemic Stroke； Interleukin 1 Beta； Tumor Necrosis Factor Alpha

金蛭方系課題組經過多年篩選出的治療缺血性中風的效方，臨床應用10余年，但其治療作用機制尚不十分明確。腦缺血后發生腦損害的機制復雜，炎性反應是缺血性腦損害的主要機制之一[1]。在參與炎癥反應的眾多因子中，最有影響的是IL-lβ和TNF-α[2]。但中藥對缺血性中風大鼠IL-1β、TNF-α水平變化影響的報道相對較少。研究旨在通過觀察金蛭方對缺血性中風大鼠血清及腦組織IL-1β、TNF-α表達的影響，探討其治療缺血性中風的部分作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級，體重250～300g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片（由遷安市中醫醫院制劑室制備），上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應研磨冰片，所含生藥分別為：0.30g/mL（高劑量）、0.15g/mL（低劑量）。尼莫地平片（國藥準字：H41022175，規格：20mg/片，鄭州瑞康制藥有限公司），按體重0.001g/mL配制成水溶液。IL-1β放射免疫分析試劑盒、TNF-α放射免疫分析試劑盒均由解放軍總醫院科技開發中心放免研究所提供。

1.3 儀器 FJ-2020型γ射線免疫計數器（國營262廠）；MSE-25型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；LAUDA-C3型循環恒溫水浴箱（泰克儀器有限公司）；F6/10型超細勻漿機（上海弗魯克流體機械制造有限公司） 。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[3]：頸部正中切口，用3-0手術絲線結扎頸外動脈（ECA）遠端及枕動脈，在結扎線距分叉部2mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進行結扎，將尼龍線經頸總動脈（CCA）[JP+1]分叉部插入頸內動脈（ICA），此時松開CCA，ICA套線恢復血流，線栓推送順滑，無出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19mm達到大腦中動脈開口處，將頸總動脈連同尼龍線一起結扎，縫合切口后外留尼龍線0.5cm，放到單籠中，2h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進行缺血后再灌注。

1.5 實驗分組與給藥[4] 60只大鼠自由進食飲水，飼養于18～22℃明暗各12h的清潔級動物實驗室內，喂養1周后，隨機分為5組。假手術組：手術時僅作頸部手術切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內動脈，術后當日灌服蒸餾水。模型對照組（簡稱模型組）：造模當日灌服蒸餾水。金蛭方低劑量組（簡稱低劑量組）：造模當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg（相當于成人劑量的10倍）。金蛭方高劑量組（簡稱高劑量組）：術后當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg （相當于成人劑量的20倍）。陽性藥尼莫地平片對照組（簡稱對照組）：術后當日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01 g/kg （相當于成人劑量的20倍）。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1mL/100g計算，連續給藥2周。

1.6 檢測方法 實驗2周末，最后1次給藥禁食12h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5 mL，注入離心管中待凝固后，4℃ 3000 r/min離心10 min，[JP+1]分離血清，-20℃保存備用。取血后，迅速斷頭冰浴中取右側大腦額葉皮層同一位置取腦組織100 g，濾紙吸干血跡，盡快加入預冷的生理鹽水碾磨，制成組織勻漿，4℃3000 r/min離心，15 min，取上清液，-20℃保存備用。放免法檢測血清及腦組織中TNF- α、IL-1β的含量，具體操作嚴格遵照試劑盒說明書。

1.7 統計學處理 數據采用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料用均數加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，多組間比較用單因素方差分析和q檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

與假手術組比較，模型組大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達顯著升高；經用藥干預后，各治療組均能降低大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達 （P<0.01）；其中，高劑量組較低劑量組和對照組大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達降低（P<0.05），低劑量與對照組之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

課題組通過對中風病臨床癥候學研究，認為缺血性中風患者多是在氣血內虛的基礎上，加之勞倦內傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡阻為本病的主要病機，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡為其有效治則組成金蛭方，研制院內制劑“金蛭膠囊”（制劑號：冀藥制字Z20051013），治療缺血性中風10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經活絡，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚，能散郁滯，順逆氣，上達高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫家認為其：“善治中風，治風圣藥”[5]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨行則勢弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡之功。

IL-lβ是最早被發現的神經細胞因子之一，根據其分子結構的不同而有2種類型：IL-Iα和IL-1β，兩者的基因結構上有20%～30%的同源性，在許多系統中作用相似，但在腦內以IL-lβ的作用為主。IL-1β在正常中樞神經系統發育和腦對各種損傷的反應中有重要的作用[6]。IL-1β的生物學作用包括刺激其它細胞因子和可溶性損傷介質的合成、誘導白細胞浸潤、影響膠質細胞的基因表達等。研究表明，IL-1β可能參與缺血性腦損傷引起的神經元死亡，在缺血性病理損傷中起重要作用[7]。

Carswell等在給接種過卡介苗的小鼠注射脂多糖（LPs）后發現，小鼠血清中出現一種能引起腫瘤出血性壞死的物質，并將其命名為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）。TNF分為TNF-a和TNF-β。TNF-a為一種細胞分泌的蛋白，屬于一種前炎癥細胞因子[8]，在觸發炎癥反應中處于中心地位，與IL-1、IL-6和生長因子共同啟動，調節大腦局部炎癥反應[9]。

研究表明，采用線栓法復制的缺血性中風大鼠模型血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α表達升高，說明IL-1β和TNF-α參與了缺血性中風的發生和發展。經藥物干預后，各治療組可降低大鼠血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α表達，表明金蛭方能調節IL-1β和TNF-α分泌和釋放，以達到減輕腦缺血炎癥、改善神經功能、預防和治療缺血性中風的作用，但其具體的作用機制有待進一步深入研究。

參考文獻

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