茄尼醇對大鼠實驗性牙周炎的影響

張蕊 汪顯國 任曉斌 李慶華 唐軍 唐麗 華一崑 劉繼輝 王慧

【摘 要】 目的：探討茄尼醇對大鼠實驗性牙周炎的影響。方法：選取SD大鼠126只，隨機分為正常組（N組），牙周炎組（P組）、維生素C組（VitC組）、茄尼醇低劑量組（S1組）、中劑量組（S2組）、高劑量組（S3組）。灌胃給藥第2、4、6周，隨機抽取6只，采血檢測血漿中IL-1β、TNF-α、PGE2、SOD、GSH-Px、MDA水平；測量大鼠牙槽骨附著喪失，并行HE染色、TRAP染色。結果：茄尼醇可降低血漿中IL-1β、TNF-α、PGE2水平；增加SOD、GSH-Px活力，減少MDA含量。結論：茄尼醇可抑制和緩解大鼠實驗性牙周炎。

【關鍵詞】 牙周炎；自由基；茄尼醇；抗氧化酶

【中圖分類號】R962 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）06-0031-10

Abstract：Objective To investigate the effect of solanesol on oxidative stress index and inflammatory factors in plasma of experimental periodontitis rats. Methods 126 healthy SD rats were randomly divided into normal group （n）， model group （P）， vitamin C group （VC）， solanesol low， medium， high dose group . Intragastric administration for week 2，4，6， 6 rats were randomly selected to detect IL-1β、TNF-α、PGE2、SOD、GSH-Px、MDA of their peripheral blood； The ABL value was detected， and the HE staining and TRAP staining were performed. Results solanesol could significantly decrease the levels of IL-1β， TNF-α， PGE2； the activity of GSH-Px and SOD increase more， and MDA decrease. Conclusion solanesol can inhibit the experimental periodontitis in rats.

Keywords：Periodontitis； Free Radical； Solanesol； Antioxidant Enzyme

牙周炎是一種牙周組織破壞的慢性炎癥性疾病，而牙菌斑是牙周炎發生的始動因子，致病菌入侵時，中性粒細胞（Neutrophil）作為首要的防御細胞，吞入病原體清除這些有害物質的過程中， 激活細胞膜上的還原型輔酶Ⅱ（Nicotinamide adenosine denucleotide hydro-phosphoric acid， NADPH）氧化酶， 氧化酶攝取大量氧，還將還原型NADPH的一個電子傳遞給氧分子而形成超陰離子自由基（（O2-），導致自由基在體內逐漸增多，引起氧化應激，造成組織破壞[1-2]。

煙草（Nicotiana tabacum）為茄科（Solanaceae）煙屬植物，廢次煙葉中含有多種化學成分，其中許多都具有較高藥用價值和營養價值，如煙堿、茄尼醇（Solanesol）、多酚類化合物等，且在廢次煙葉中茄尼醇含量突出為0.5%～2.7%[3]。茄尼醇作為一種天然化合物，屬于九聚異戊二烯伯醇或四倍半萜烯醇，分子式為 C45H14O，不溶于水。研究發現茄尼醇在煙草、馬鈴薯和桑葉中的含量較豐富，尤其是煙葉中茄尼醇含量最高，使得煙葉成為提取茄尼醇的主要原料[4-5]。當前，國際上以茄尼醇為原料的新藥研制工作非常活躍，茄尼醇作為一種重要的醫藥中間體，很多藥物連接上茄尼醇這樣的長鏈烯基，往往能獲得某些優良的性能[6]。文獻報道，茄尼醇本身含有多個非共軛雙鍵，以及它特殊的全反式鏈節結構使它具有非常強烈的吸收自由基的性能[7]和脂質抗氧化作用[8]。因此，其本身也有望成為有醫療效果的生化物質。

牙周炎的治療，除了控制牙周致病菌，外源性補充抗氧化劑，可以通過調節免疫和氧化應激反應，提高體內抗氧化酶的活性，從而有效改善體內氧化還原平衡而緩解牙周組織的損傷[9]。因此，實驗將以煙草中提取的茄尼醇為研究對象，通過應用牙周炎模型，初步探討茄尼醇對牙周炎的影響作用，為其在牙周炎中的治療或者改善牙周組織的狀況提供實驗參考數據。

1 材料和方法

1.1 儀器 YVITC001N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、Mettler Toledo高精密電子分析天平（Mettler Toledo公司）、DT5-1 離心機（時代北利）、BM-IX生物組織包埋機（孝感市宏業醫用儀器有限公司）、石蠟切片機（上海市醫療器械工業公司醫療器械批發部修配廠）。

1.2 試劑 水合氯醛（Solarbio）；食用調和油（上海香滿園，批號：20140829）；茄尼醇（純度為97 %，云南云藥醫藥研究有限公司）；SOD試劑盒（批號：20150708）、GSH-Px試劑盒（批號：20150708）、MDA試劑盒（批號20150708）等購置南京建成；TNF-α試劑盒（批號165232）、IL-1β試劑盒（批號154256）等購置深圳欣博盛；PGE2試劑盒（美國 RD公司）、TRAP試劑盒（Sigma，批號：SLBM2508V）。

1.3 實驗動物及分組 選取四川省簡陽市簡城比爾動物養殖場提供的清潔級雄性SD大鼠126只，6周齡，體重180～220g（合格證號：SCXK（川）2013-24）。實驗過程中遵循動物福利倫理原則。大鼠隨機分為正常組（N組，18只），牙周炎建模組108只。通過雙側上頜第二磨牙絲線結扎配合黏性高糖飲食4周建立牙周炎模型。成模后，牙周炎大鼠再隨機分為牙周炎組（P組）、維生素C組（VitC組）、茄尼醇低劑量組（S1）、中劑量組（S2）、高劑量組（S3），每組18只。

1.4 牙周炎模型的建立及給藥 實驗動物適應性喂養l周后，10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定四肢，用4/0 #醫用絲線，在大鼠雙側上頜第二磨牙環牙頸部結扎，腭側打結，并使絲線盡量位于齦溝內[10]。同法結扎對側上頜第二磨牙，并從實驗當天開始喂養l00g/L蔗糖和軟食（常規鼠料用蔗糖水泡制）。建模成功后，每天早晨9點茄尼醇低、中、高劑量組分別按1.5 mg、3.0 mg、6.0 mg/100 g BW給藥，維生素C組按10 mg/100 g BM給藥[11]，茄尼醇通過食用調和油稀釋，VitC通過生理鹽水稀釋。正常組和牙周炎模型組灌胃等體積的食用調和油，灌胃體積0.1 mL / 100 g。

1.5 模型的評估 4周后隨機抽取建模大鼠4只，脫頸椎猝死，取其上頜骨，去凈軟組織，用電子數顯卡尺測量上頜第二磨牙釉牙骨質界至牙槽嵴頂的距離[12]作為此牙的牙槽骨喪失值來評估模型是否成功。

1.6 標本采集 分別于灌胃后的2、4、6周末三個時間點每組隨機抽取6只大鼠，在10 % 水合氯醛腹腔麻醉后腹主動脈采血。采血后，迅速分離上頜骨，一分為二，右側上頜骨浸泡于4 %多聚甲醛固定液中，用于HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色觀察炎癥變化和破骨細胞數量。左側上頜骨置于75%酒精中，用于測量牙槽骨喪失程度（alveolar bone loss， ABL）。

1.7 血液的檢測 收集的腹主動脈血3600 r/min，離心10 min，血漿-80 ℃保存，用于ELISA檢測炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α， TNF-α）、白介素1β （inteleukins1-β， IL-1β）、前列腺素E2 （prostaglandin E2， PGE2）蛋白表達水平，分別用羥胺法和DTNB法檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase， GSH-Px）的活性，TBA法檢測丙二醛（malodiadehyde， MDA）含量。

1.8 牙槽骨喪失的測定 取左側上頜骨，去盡軟組織，用電子數顯卡尺測量上頜第二磨牙釉牙骨質界至牙槽嵴頂的距離，每顆牙齒分別測量近頰、中頰、遠頰、近腭、中腭、遠腭6個位點，取6個位點測量值的均值。三個時間點每組大鼠的ABL 值以“ x[TX-*3]±s” 表示。

1.9 組織學檢測

1.9.1 HE染色 取右側上頜，4 % 多聚甲醛固定液4 ℃ 條件下固定24 h，15 % EDTA 脫鈣液脫鈣3～4周。系列乙醇脫水，二甲苯置換至石蠟包埋。近遠中向連續5 μm厚石蠟切片，切片常規HE染色，在光鏡下觀察第一、二磨牙間和第二、三磨牙間的牙周組織病理變化。

1.9.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP染色） 按試劑盒說明進行Trap染色。破骨細胞鑒定標準為：胞核顯多核、胞漿嗜酸性多偽足、胞體大而不規則，與牙槽骨表面直接接觸或位于骨吸收陷窩內，行Trap染色后胞漿被染為紅色，胞核為藍色[13]，在400倍鏡下，每張切片以牙槽嵴頂為起始，隨機選取第二磨牙近遠中側牙槽嵴邊緣的4個不重疊視野，分別計算每一個視野內的破骨細胞數，共計8個視野，并計算其均值，作為該片的破骨細胞數，每組4張切片，并進行統計。

1.10 統計學分析 應用SPSSl7.0軟件包分析處理實驗數據，采用單因素方差分析和LSD檢驗比較同一時間點6個組間的差異。所有組的數據使用K-S檢驗正態性，數據為正態性分布，使用單因素方差分析對6個組相應指標的均數進行顯著性檢驗，并通過LSD檢驗進行樣本均數的兩兩比較，以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建模大鼠牙周情況 隨機抽取建模大鼠檢測牙周組織情況，其牙頸部較多的軟垢堆積，牙齦顏色鮮紅、邊緣圓鈍，紅腫剝離，牙齦輕觸出血，HE染色可見大量炎癥細胞浸潤及紊亂的牙周膠原纖維束。去盡牙齦軟組織可見牙槽嵴頂模糊呈蟲蝕狀，嵴頂呈凹陷狀，第二磨牙釉牙骨質界至牙槽嵴頂的距離模型組（0.90±0.07）顯著高于正常組（0.30±0.07）。如圖1所示。

2.2 給藥后大鼠的一般特征和牙周情況

2.2.1 一般特征 由表1可知，灌胃期間，各組大鼠體重都在逐漸增加。灌胃2周末，正常組大鼠體重較重，與牙周炎組相比，差異有統計學意義（P<0.05），與茄尼醇各劑量組相比無明顯差異（P>0.05）。灌胃4周末，正常組大鼠體重明顯高于茄尼醇劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。灌胃6周末，各組大鼠體重兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2.2 各組大鼠牙槽骨喪失情況 由表2可知，灌胃2周、4周、6周后，與牙周炎組相比，茄尼醇各劑量組大鼠ABL有改善趨勢，但是改善程度不明顯，差異無統計學意義（P>0.05），茄尼醇用藥組的牙槽骨喪失明顯多于正常組，差異均有統計學意義（P<0.05），茄尼醇各劑量組間兩兩比較差異也無統計學意義（P>0.05）。

2.3 組織學觀察 由圖2～4可知，灌胃2周、4周和6周后，正常組：上皮附著位于釉牙骨質界處，無附著喪失（藍色箭頭所示）。牙周膜纖維排列整齊，牙槽嵴頂高度正常，無明顯的炎癥細胞浸潤。牙周炎組：牙周袋內壁上皮顯著增生，牙周組織大部分膠原纖維束紊亂甚至纖維束出現斷裂，周圍毛細血管擴張充血，冠1/3以上部位少量牙槽骨存在，結締組織充滿這些間隙內，袋底的結合上皮不規則的向根方退縮，牙槽骨高度明顯降低。茄尼醇各劑量組及VitC組間差異不明顯，均可發現牙周組織不同程度的破壞，牙槽骨高度降低，牙周袋和牙槽骨之間有粗大的膠原纖維束，結締組織內浸潤的炎癥細胞，但牙周組織破壞較牙周炎組有改善趨勢。

2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP染色） 光學顯微鏡下觀察，多核破骨細胞內酶活性部位呈現紅色沉淀，胞核染色藍色（見圖5）。對TRAP染色切片于400倍顯微鏡放大視野下觀察計數，比較同一時間點不同組別之間破骨細胞數目變化情況，結果發現，牙周炎組大鼠破骨細胞數目明顯多于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）。茄尼醇灌胃后破骨細胞數目與牙周炎組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。但隨著灌胃時間的增加，各組的破骨細胞數目都有逐漸減少的趨勢（表3）。

2.5 血漿中炎癥因子的表達

2.5.1 茄尼醇對血漿中致炎因子IL-1β含量的影響作用 由表4可知，灌胃2周、4周、6周后牙周炎組血漿中IL-1β的濃度高于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）。茄尼醇給藥后三個劑量組IL-1β的濃度均低于牙周炎組，差異有統計學意義（P<0.05）。隨著灌胃時間增加，到灌胃6周后，茄尼醇高劑量組IL-1β的濃度與正常組及VitC組無明顯差異（P>0.05）。

2.5.2 茄尼醇對血漿中致炎因子TNF-α含量的影響作用 由表5可知，灌胃2周、4周、6周后三個時間點，牙周炎組TNF-α生成水平高于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）。茄尼醇灌胃后，TNF-α生成水平均顯著低于牙周炎組（P<0.05）。灌胃4周和6周后，茄尼醇三個劑量組TNF-α的生成水平與VitC組相比差異無統計學意義（P>0.05）。且在6周時茄尼醇高劑量組TNF-α的生成水平與正常組相比差異無統計學意義（P>0.05）。

2.5.3 茄尼醇對血漿中致炎因子血PGE2含量的影響作用 由表6可知，結果表明灌胃2周、4周、6周后，茄尼醇三個劑量組與牙周炎組相比，大鼠血漿中PGE2的生成水平均明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05），與VitC組相比差異無統計學意義（P>0.05）。隨著灌胃時間增加，到6周末，茄尼醇三個組血漿中PGE2的濃度與正常組相比差異無統計學意義（P>0.05）。

2.6 大鼠血漿中氧化應激指標的變化

2.6.1 茄尼醇對血漿中MDA含量的影響作用 由表7可知，灌胃2周、4周、6周后，牙周炎組MDA的生成水平顯著高于正常組（P<0.05）。茄尼醇給藥后三個劑量組MDA的生成水平都顯著降低，與牙周炎組相比，差異均有統計學意義（P<0.05），灌胃2周和4周后，茄尼醇低劑量組MDA的生成水平接近正常組，差異無統計學意義（P>0.05）。到灌胃6周后，茄尼醇三個組MDA的生成水平均與正常組接近，差異無統計學意義（P>0.05）。灌胃同一時間點末茄尼醇各劑量組兩兩比較，差異也無統計學意義（P>0.05）。

2.6.2 茄尼醇對血漿SOD活性的影響作用 由表8可知，灌胃2周、4周、6周后牙周炎組SOD活性均低于正常組，茄尼醇給藥后三個劑量組SOD活性都明顯高于牙周炎組，差異有統計學意義（P<0.05），灌胃2周和4周后茄尼醇三個劑量組和正常組及VitC組相比差異均無統計學意義（P>0.05）。到灌胃6周后，茄尼醇高劑量組與正常組、VitC組相比差異仍無統計學意義（P>0.05）。同一時間點末，茄尼醇三個劑量組兩兩相比差異無統計學意義（P>0.05）。

2.6.3 茄尼醇對血漿中GSH-Px活性的影響作用 由表9可知，灌胃2周、4周、6周后，牙周炎組GSH-Px活性都低于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）。茄尼醇給藥后，三個劑量組的GSH-Px活性都高于牙周炎組，差異有統計學意義（P<0.05）。到4周末，茄尼醇低劑量組GSH-Px活性與正常組接近，差異無統計學意義（P>0.05）。到6周末，茄尼醇高劑量組的GSH-Px活性繼續升高與正常組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。三個時間點末，茄尼醇三個劑量組兩兩相比，差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

煙草化學成分多種多樣，其中許多都是具有一定應用價值的生物活性物質，這些物活性成分主要有煙堿、茄尼醇、綠原酸、蘆丁、功能蛋白、活性多糖等[14]。煙草中的萜類化合物茄尼醇、酚類化合物綠原酸以及黃酮類物質都有一定的抑菌、抗炎以及較好的清除自由基的能力，是具有潛力的抗氧化劑[15-17]。牙周炎癥中，研究發現在自由基過量或抗氧化劑不足的條件下，增多的自由基可直接參與菌斑-宿主免疫反應，自由基在牙周組織損傷的致病機理中起著一定的作用[18]。從而也暗示我們調控炎性因子和自由基的生成對牙周病的發生和治療起著重要作用。研究發現茄尼醇具有較強的抗生物活性[19]，但其在牙周炎的防治中是否起到作用，目前鮮見相關報道。因此，實驗通過實驗性牙周炎大鼠模型對煙草提取物茄尼醇的潛在療效進行評估。

牙槽骨吸收總量可以客觀地反映牙周破壞程度，衡量和判斷牙周組織狀況，是牙周病診斷中重要的檢查指標。本實驗中牙周炎組牙周組織破壞最嚴重，牙槽骨喪失較多。給藥2周、4周、6周后，維生素C組以及茄尼醇各劑量組牙齦炎癥減輕，探診出血減少。HE染色可發現膠原纖維紊亂和斷裂有所減輕，結合上皮及牙周膜內的炎癥細胞數目減少，但炎癥反應并沒有恢復到正常水平。灌胃期間牙周炎組ABL也出現逐漸改善的情況，說明局部刺激因素去除后，大鼠牙周組織有一定的自我恢復能力，結果與張鯤的研究結果相符合[20]。但是，茄尼醇組ABL以及破骨細胞計數與牙周炎組相比差異沒有統計學意義，其中年齡可能是一個影響因素，大鼠開始灌胃時已有11周齡，本實驗中灌胃2、4、6周三個時間段，成年大鼠要觀察到骨修復可能時間需要適當延長[21]。此外，由于本實驗是關于茄尼醇對牙周炎作用的初步探討，茄尼醇的用量以及用藥時間需要進一步的研究。

TNF-α和IL-1β在牙周炎的發生發展中起著關鍵的作用，IL-1β和 TNF-α 能夠募集炎癥細胞，誘導PGE2和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPS）的產生，抑制膠原合成，刺激骨吸收、組織降解以及基質細胞的凋亡從而限制了牙周組織的修復[22]。本實驗顯示牙周炎組血漿中TNF-α、IL-1β濃度最高（P<0.05），給藥2、4、6周后，茄尼醇劑量組下調了血漿中炎癥因子的表達，其抗炎效果與維生素C組相似，我們推測茄尼醇下調炎癥因子可能是通過調控NF-κB而實現。研究顯示在牙周組織中NF-κB的激活率達到了75 %～ 90 %，明顯的高出了正常組織的5 %～ 30 %，NF-κB又能上調炎癥因子的表達，表明了NF-κB的活化在牙周炎的發生發展中也起著重要因素[23]。

在牙周炎發展過程中，機體內菌斑-宿主免疫反應，使機體產生過度的活性氧（包括氧化自由基和非自由基活性物質），長久后引起機體抗氧化酶水平下降。超氧化物歧化酶（SOD）作為機體重要的抗氧化酶，是機體內唯一能夠清除生物氧化所產生的超氧陰離子的酶[24]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是一種廣泛存在于機體組織細胞線粒體、胞質內以及生物膜上的水溶性四聚蛋白酶，它不僅可以清除過氧化氫，同時還可以清除脂質過氧化物[25]。丙二醛（MDA）是自由基與多聚不飽和脂肪酸反應的終末產物，在機體內其含量的高低間接反映了細胞受到自由基攻擊后的損傷程度[26]。實驗期間，牙周炎組SOD和GSH-Px這兩種酶的活性明顯下降，MDA的含量升高。可能由于牙周炎癥期間外周血中PMNs處于較敏感的反應狀態，產生并釋放大量的自由基[27]。茄尼醇灌胃2周、4周、6周后，SOD和GSH-Px的活性都出現增加，MDA含量降低，與牙周炎組相比，有顯著性差異（P<0.05）。茄尼醇組的抗氧化作用效果和維生素C組相似，暗示茄尼醇潛在的抗氧化活性，但是茄尼醇的抗氧化機制尚不清楚。

綜合體內動物實驗數據發現茄尼醇有較好的抗炎和抗氧化的性能，但作用機制尚不清除。根據相關實驗數據和結果推測可能有以下的原因：首先，大鼠通過結扎誘導牙周炎癥模型，創傷和感染引起宿主的免疫應答反應，宿主細胞在清除病原體的過程由于“呼吸爆發”作用產生大量的自由基。茄尼醇其自身特殊的多共軛雙鍵結構可以清除自由基[19]，改善大鼠的氧化應激狀態，阻止機體細胞胞漿中對氧化還原敏感的核轉錄因子NF-κB入核[28]，下調炎性細胞因子的生成。其次，茄尼醇可能作用于機體內的抗氧化反應原件（antioxidant responsive element， ARE）誘導機體抗氧化酶系統產生抗氧化需要成分（SOD、CAT、GSH-Px），從而增強大鼠抗氧化能力影響其牙周炎的進展。

總之，灌胃茄尼醇后減輕了結扎誘導的牙周炎大鼠全身氧化應激狀態和炎性因子的表達，研究結果可為茄尼醇的臨床應用及改善牙周狀態提供實驗參考數據。但是實驗中茄尼醇促使牙周炎愈合的機理尚不明確，后續實驗中需要深入探索明確其作用機理。

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