焦磷酸測序鑒定建澤瀉方法的建立

盧雪花 孫鳳靈 李麗莎

【摘 要】 目的：建立一種基于內部轉錄間隔區2（ITS 2）序列突變位點鑒別建澤瀉的焦磷酸測序方法。方法：分別提取建澤瀉與川澤瀉的須根、葉片、葉柄DNA，采用焦磷酸測序方法進行分析鑒定，并通過毛細管電泳測序驗證方法的正確性。結果：建立了一種基于ITS 2序列焦磷酸測序鑒定方法，經毛細管電泳測序驗證結果準確可靠。建澤瀉ITS 2序列中的突變位點A-T的突變頻率均不小于83%。結論：焦磷酸測序方法可以準確鑒定不同基源的澤瀉物種。

【關鍵詞】 焦磷酸測序；建澤瀉；鑒定；ITS 2

【中圖分類號】R286.0 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）16-0026-03

Abstract：Objective Establish a pyrosequencing method based on the ITS 2 sequence mutation sites to identify Alisma orientalis. Methods DNA was extracted respectively from roots， leaves and petiole of Alisma orientalis and analyzed by pyrosequencing. The correctness of the method was verified by capillary electrophoresis sequencing. Results A pyrosequencing method based on the ITS 2 sequence was established. This method was verified by capillary electrophoresis sequencing to be accurate and reliable. The mutation frequency from A to T site was not less than 83% in the ITS 2 sequence of Alisma Orientalis. Conclusion Pyrosequencing can accurately identify Alisma species from different sources.

Keywords：Pyrosequencing； Alisma Orientalis； Identification； ITS2

澤瀉為多年沼生澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis （Sam.）Juzep.的干燥塊莖，最早歷史記載可追溯到《神農本草經》。其性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效[1]，主要有利尿[2]、降血糖[3-5]，降血脂[6-9]等活性。澤瀉主產福建、四川、江西等地，素有“建澤瀉”、“川澤瀉”、“江澤瀉”之稱，以建澤瀉、川澤瀉量大且使用廣泛，其中又以建澤瀉質佳，被載入中國的道地藥材。目前主要采用性狀鑒別和化學成分分析對澤瀉進行鑒定，該方法鑒定結果主觀性較強，準確性無法得到保證。焦磷酸測序技術（Pyrosequencing） 是一種基于酶催化反應的新一代測序技術，其精確性和可重復性高，并能夠實時、直觀地提供序列信息，同時能定性定量分析差異堿基。該技術利用生物素標記一條擴增引物，擴增產物無需熒光標記與電泳分離，因此操作更為簡便、快捷。本實驗采收福建省建甌建澤瀉藥材，同時以川澤瀉作為對照藥材（采自四川省眉山），采用焦磷酸測序方法鑒定其基源，為今后澤瀉的質量控制研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PCR儀（美國Bio-Rad）；高速離心機（德國eppendorf）；生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）；超微量核酸/蛋白分析儀（英國Biochrom）；數顯恒溫水浴鍋（江南儀器廠）；電泳儀（六一儀器廠）；暗箱式紫外投射儀（上海顧村電光儀器廠）；實時定量焦磷酸測序儀（凱杰生物工程有限公司）；恒溫孵育器（德國eppendorf）。

1.2 材料 建澤瀉藥材采自福建省建甌吉陽鎮，川澤瀉藥材采自四川省眉山市彭山區謝家鎮，經福建省醫學科學研究院徐榕青研究員鑒定為澤瀉科植物澤瀉。分別取建澤瀉與川澤瀉的須根、葉柄及葉片樣本。

1.3 試劑 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均購自凱杰生物工程有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（AS111-14）購自北京全式金生物技術有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國BIOSHAPR；三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖購自美國NOVON；其余試劑均為國產分析純；實驗引物由鉑尚生物技術公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分別提取建澤瀉、川澤瀉的須根、葉柄及葉片DNA。

2.2 PCR擴增 25μL PCR擴增體系中包含有1μL DNA模板（約50～100ng），12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，10μmol/L上下游引物各1μL（引物序列見表1），用ddH2O補足至25μL。擴增條件為94℃-5min；（94℃-30s，58℃-30s，72℃-45s）×30 cycle；72℃-5min；擴增產物保存于4℃。

2.3 焦磷酸測序 取5μL PCR產物、1μL的beads、40μL bingding buffer，補足MQ至80μL，25℃1400rpm振蕩孵育10min。經變性和洗滌后，使未標記生物素的DNA單鏈與已標記單鏈分離，將含有beading的反應板于80℃孵育2min后冷卻至室溫。試劑倉中加入所需的酶、底物和dNTP等進行檢測。

2.4 測序驗證 中藥材DNA條形碼鑒定系統中查詢所得ITS2序列上游引物：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，下游：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR擴增條件為94℃-5min；（94℃-30s，56℃-30s，72℃-45s）×30 cycle；72℃—10min；擴增產物于4℃保存。未經純化的PCR產物送鉑尚生物技術有限公司測序。

3 結果與分析

3.1 焦磷酸測序結果 采用焦磷酸測序技術進行SNP分析。根據ITS2位點突變情況，得兩種峰圖，建澤瀉（含須根、葉柄、葉片）突變位點堿基為A（如圖1所示），川澤瀉（含須根、葉柄、葉片）突變位點堿基為T（如圖2所示），二者突變頻率均不小于83%（見表2）。

3.2 測序驗證結果 測序序列與下載序列見表3，同時由圖3可以看出，建澤瀉ITS2序列與東方澤瀉一致，與澤瀉存在A-T突變；川澤瀉ITS2序列與澤瀉一致，與東方澤瀉存在A-T突變。有研究表明東方澤瀉與澤瀉在ITS2序列上的A-T變異是穩定突變，因此可準確鑒定這兩個物種[10]。故可判斷建澤瀉與東方澤瀉基源一致，即Alisma orientalis （Sam.）Juzep.

4 討論

實驗采用焦磷酸測序技術對ITS2突變位點進行研究，發現建澤瀉與川澤瀉在突變位點堿基不同，且毛細管電泳測序技術進一步驗證了這一結果，說明焦磷酸測序結果的準確性，因此本實驗建立的基于ITS2突變位點的焦磷酸鑒定技術能準確鑒定不同產地的澤瀉物種。與直接測序法相比，焦磷酸測序所用DNA不需要經過凝膠電泳純化和熒光標記，測序過程中可對測序結果實時觀察，同時能定性定量分析差異堿基，靈敏度高，操作便捷，適合已知序列的DNA短片段測序，是一種適用于中藥材的分子生物學鑒定手段。

參考文獻

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（收稿日期：2018-06-08 編輯：程鵬飛）