大鱗副泥鰍群體線粒體DNA D-loop序列遺傳變異分析

白曉慧，楊 華，孟一耕，王 娜，姜巨峰，吳會民，馮守明

( 天津市水產研究所，天津 300221 )

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)俗稱黃板鰍，為小型淡水經濟魚類，屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，分布于我國的黑龍江、遼河中下游、海河、黃河、長江、錢塘江、臺灣等水系[1]。天津市位于海河流域下游，是海河五大支流的匯合處和入海口。20世紀初，天津濕地面積約 53×104hm2。進入21世紀后，由于濕地水資源匱乏，人工圍墾養殖、旅游開發及水環境污染等原因，天津天然濕地面積不斷減少[2-3]，天然經濟魚類資源受到很大的破壞，資源量不斷減少，并出現小型化和低齡化趨勢，生物多樣性受到嚴重威脅[4]。天津寶坻區是華北地區唯一的泥鰍出口地，近年來，由于國內外市場需求的不斷增大，大鱗副泥鰍的養殖規模也在不斷擴大。養殖的苗種多為野生捕撈或者野生親本繁殖而來，由于棲息環境的不斷惡化和捕撈強度的增大，大鱗副泥鰍的野生資源在不斷減少。生物的遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，也是種質資源保護和利用的前提和基礎。線粒體D-loop區是線粒體上重要的非編碼區，由于受選擇壓力較小，其進化速率是線粒體其他區域的5～10倍，更適用于種內不同群體和相近物種間的遺傳多樣性分析[5]。國內對天然水域大鱗副泥鰍線粒體遺傳多樣性的研究僅見于黃河流域的山西臨汾、河南新鄉和山東濟南群體[6]，安徽省的懷遠、舒城、池州群體[7]及南四湖群體[8]。本研究通過對天津5個主要濕地大鱗副泥鰍群體線粒體D-loop序列進行多態性分析，探明其遺傳背景，以期為大鱗副泥鰍種質資源保護和合理開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

5個大鱗副泥鰍群體分別采自薊州區于橋水庫、武清區大黃堡濕地、寧河區七里海濕地、靜海區團泊水庫和寶坻區潮白新河(圖1)，共72尾。樣本取鰭條放入裝有無水乙醇的離心管中，-80 ℃保存備用。

1.2 基因組DNA的提取、序列擴增及測序

采用醋酸銨沉淀法[9]提取基因組DNA。具體步驟為：每個樣本剪取鰭條組織約0.2 g放于2 mL離心管中，用剪刀將組織剪碎，加入600 μL的細胞裂解液(Tris-HCl 100 mmol/L，pH 8.0；EDTA 50 mmol/L，pH 8.0；SDS 1%；NaCl 125 mmol/L)和8 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，放入65 ℃水浴鍋中水浴2～3 h，每隔30 min搖勻一次，直至組織充分裂解。將離心管冷卻至室溫，加入200 μL 7.5 mol/L的醋酸銨，充分搖勻，冰上冷卻5 min或4 ℃冷卻10 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液至新離心管。加入與上清液等體積的異丙醇，輕輕搖勻，室溫下沉淀1～2 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液。加入70%的酒精1 mL洗滌DNA，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，加入無水乙醇1 mL，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄無水乙醇，室溫干燥約20 min，加入50 μL雙蒸水溶解DNA。用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計檢測DNA含量和質量，將各DNA樣品稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存備用。

圖1 5個大鱗副泥鰍群體采樣位置

基于GenBank 中大鱗副泥鰍線粒體基因組全序列(NC_023803.1)，用Primer premier 5.0 軟件進行擴增引物設計，引物序列為：MiPd-D1-F，5′-CCAGTAGAACACCCATTT-3′；MiPd-D1-R，5′-ATAAAGTCAGGACCAAGC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。序列擴增反應體系為50 μL：5 μL 10×Buffer，5 μL dNTP(10 mmol/L)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，2.5 μL模板DNA，0.5 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，ddH2O 35 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，33個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送上海生工生物工程有限公司用擴增引物進行雙向測序。

1.3 數據分析

將測序結果用BioEdit 7.0.5軟件[10 ]進行編輯校正，用Mega 6.0軟件[11]進行同源比對，確定序列長度，并統計DNA序列的堿基組成，構建分子系統樹；用DnaSP 5.1軟件[12 ]計算單倍型數、單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數和基因流。用TCS 1.21軟件[13]構建單倍型網絡進化圖，檢測單倍型之間的進化關系。用ARLEQUIN 3.5.1.2軟件[14]計算種群間的遺傳分化指數并進行顯著性檢驗，同時進行Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗以及核苷酸不配對分析，計算τ值。按下式計算種群擴張時間：

t=τ/2μk

式中，t為自群體擴張開始到現在的時間，τ為擴張時間參數，μ為D-loop基因的突變速率，k為序列長度。

在本研究中，D-loop基因的進化速率采用3%～10%每百萬年進行計算[15]。最終的擴張時間T=t×生殖周期。天然水域條件下，大鱗副泥鰍性成熟年齡為2齡，因此生殖周期按2年計算。

2 結 果

2.1 序列變異及群體遺傳多樣性

測序結果經過校正和比對分析，獲得5個群體72個個體的線粒體D-loop序列，長度為912～914 bp。Mega 6.0軟件分析結果顯示，該序列的A、T、G、C堿基平均含量分別31.5%、36.0%、18.6%、13.9%，A+T含量(67.5%)明顯高于G+C含量(32.5%)。所比對序列中共檢測出多態性位點30個(包括4個插入/缺失位點)，其中簡約信息位點5個，單突變位點21個，轉換/顛換平均值為1.958。

5個群體72個個體共檢測到22個單倍型，單倍型序列GenBank登錄號為KY441417～KY441438。單倍型在5個群體中的分布見表1，其中6個單倍型為群體共有單倍型，16個單倍型為各群體獨有的單倍型。5個群體的多樣性信息見表2，總體的單倍型多樣性為0.813，核苷酸多樣性為0.0015。潮白新河群體的單倍型數和單倍型多樣性最高，其次為團泊水庫和七里海濕地群體，于橋水庫群體最低。七里海濕地群體的核苷酸多樣性最高，其次為團泊水庫和潮白新河群體，于橋水庫群體最低。

2.2 群體遺傳結構及歷史動態分析

Arlequin軟件計算得到的5個群體間的遺傳分化指數見表3，潮白新河和團泊水庫群體及二者和其他群體間的遺傳分化指數為-0.0205～0.0427，群體間分化較小(P>0.05)。七里海濕地、大黃堡濕地和于橋水庫3個群體間的遺傳分化指數為0.0496～0.0795，屬中等程度的遺傳分化(P<0.05)。

單倍型網絡進化圖顯示(圖2)，5個群體的單倍型個體呈交錯分布，無明顯的地理分支，Hap 1的個體最多，位于單倍型網絡進化圖的中央，為5個群體共享，其他單倍型通過2～10步突變與之連接。采用鄰接法和最大似然法構建的單倍型系統發育樹也未表現出明顯的與地理分布相對應的分化譜系，表明5個大鱗副泥鰍群體未分化成明顯的地理譜系(圖3)。

經中性檢驗，Tajima′sD檢驗及Fu′sFs檢驗結果均為負值，潮白新河群體和團泊水庫群體的Fu′sFs統計檢驗顯著(P<0.05)，七里海濕地、大黃堡濕地和于橋水庫3個群體的Tajima′sD統計檢驗顯著(P<0.05)(表4)。將5個群體作為1個整體進行中性檢驗，Tajima′s D=-2.241(P=0.001)，Fu′s Fs=-25.139(P<0.001)，兩個值的統計檢驗均顯著。在核苷酸不配對分布檢驗中，SSD和R指數兩個參數的統計檢驗均不顯著(P>0.05)，說明未顯著偏離群體擴張模型。以上這些證據均表明大鱗副泥鰍可能經歷過種群擴張。根據5個群體的整體擴張參數值(τ=3.31)，估算出大鱗副泥鰍種群擴張事件發生在第四紀更新世晚期(12.1～3.6萬年前)。

表1 大鱗副泥鰍5個群體的變異位點及各單倍型在群體中的分布

表2 大鱗副泥鰍5個群體D-loop序列的遺傳多樣性參數

表3 大鱗副泥鰍5個群體間的遺傳分化指數(對角線下)及其相關P值(對角線上)

圖2 22個mtDNA D-loop 單倍型的網絡進化關系示意

圖3 基于大鱗副泥鰍 22個單倍型序列構建的系統樹 節點數字代表1000次Bootstrap統計分析后對該支的支持百分比(≥50%)，線上為鄰接法，線下為最大似然法.

群體Tajima's DFu's Fs不配對分布檢驗SSDRτ潮白新河 -0.946-3.5678*0.00120.03013.83團泊水庫-1.439-2.68467*0.00650.04553.54七里海濕地-1.608*-1.8380.02220.06803.54大黃堡濕地-1.863*-1.0900.01300.10572.14于橋水庫-1.685*-1.2870.00010.09412.23總體-2.241*-25.139*0.01170.05283.31

3 討 論

3.1 大鱗副泥鰍群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種生存適應和發展進化的前提，也是評價種群資源狀況的重要依據，一個物種的遺傳多樣性水平越高，其進化的潛力及環境適應能力也越強。按照Grant等[16]的分類，單倍型多樣性以0.5為臨界值，核苷酸多樣性以0.005為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。在本研究的5個大鱗副泥鰍群體中，除于橋水庫群體外，其他4個群體均具有較高的單倍型多樣性(0.7308～0.9080)，但5個群體的核苷酸多樣性均較低(0.0004～0.0022)。總體來看，5個群體的單倍型多樣性為 0.8130，核苷酸多樣性為0.0015，屬高單倍型多樣性，低核苷酸多樣性群體，其多樣性水平低于南四湖大鱗副泥鰍群體[8]和安徽4個野生泥鰍群體[17]以及翹嘴鲌[18](Culteralburnus)、松江鱸(Trachidermusfasciatus)[19]等經濟魚類。高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式在翹嘴鲌[18]、松江鱸[19]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[20]、南四湖湖鱭(Coiliaectenestaihuensis)[21]、鳊(Parabramispekinensis)[22]等多種魚類均見報道，這種情況可能是由于種群經過瓶頸效應穩定后發生了擴張，種群的快速增長有利于新突變的保持而使單倍型多態性增加，但還未能達到核苷酸序列的多樣化[23]。

3.2 種群遺傳結構及歷史動態

遺傳分化指數是用來評價亞群間遺傳分化程度的重要指標，遺傳分化指數<0.05 表明群體間分化較小；遺傳分化指數為0.05～0.15，表明群體間存在中等分化；遺傳分化指數為0.15～0.25，表明群體間高度分化[24]。總體來看，本研究中5個群體的遺傳分化為中等水平。天津地跨海河兩岸，海河是華北最大的河流，支流眾多，本研究中的潮白新河、七里海濕地、團泊水庫和大黃堡濕地4個群體由海河流域的幾大干流及支流相連通，使得4個群體間基因交流成為可能，造成群體間遺傳分化程度不高。當基因流值>5時，說明種群間基因交流頻繁，各群體為一個大的隨機單元[25]。本研究中，5個群體的平均基因流值為3.26，且5個群體均有各自特有的單倍型，說明各群體間尚未有大范圍、頻繁的基因交流。這可能與大鱗副泥鰍的生活習性有關，大鱗副泥鰍屬底層魚類，產黏性卵，其生活習性限制了魚的遷移行為和種群間的基因交流[26]。

單倍型網絡進化圖未檢測到與地理分布相對應的分化譜系，單倍型Hap 1為5個群體共享，位于單倍型網絡進化圖的中央，推測可能為祖先單倍型，說明5個大鱗副泥鰍群體可能起源于同一個祖先群體。中性檢驗和核苷酸不配對分布結果均提示大鱗副泥鰍可能經歷過種群擴張，推算的擴張時間在晚更新世。自晚更新世以來，天津地區主要發生了3次大的海進海退事件——滄州海侵、獻縣海侵和黃驊海侵，七里海濕地就是全新世晚期以來海退過程在天津平原殘留下來的眾多潟湖之一[27]。由此推斷，天津地區5個大鱗副泥鰍群體可能起源于同一個祖先群體，受晚更新世海進海退的影響形成了種群隔離，在棲息地逐漸穩定后發生了擴張。

3.3 大鱗副泥鰍的種質資源保護與管理

本研究的大鱗副泥鰍群體為海河水系的主要濕地群體，5個種群作為1個整體來看，單倍型多樣性程度較高，但仍低于其他經濟魚類[17-19]，且核苷酸多樣性處于較低水平，其漁業資源現狀不容樂觀。因此，建議加強對天津主要濕地水環境的保護力度，同時，建立天津地區大鱗副泥鰍原種場，加強對大鱗副泥鰍天然種質資源的保護，并選用遺傳多樣性高的群體開展大鱗副泥鰍人工苗種繁育和良種選育工作，以保證市場的需要，減少對大鱗副泥鰍野生資源的破壞。