牡蠣皰疹病毒流行病學及其防控研究進展

胡宗福，任紹杰，牛化欣，于建華，常 杰，李樹國

( 內蒙古民族大學 動物科技學院，內蒙古 通遼 028000 )

作為迄今為止僅有的一種軟體動物皰疹病毒，牡蠣皰疹病毒(Ostreidherpesirus-1，OsHV-1)的分類地位及命名是由國際病毒分類委員會于2012年正式確立的，即皰疹病毒目、軟體動物皰疹病毒科、皰疹病毒屬(Ostreavirus)[1]。由此看來，牡蠣及其他貝類的皰疹病毒皆屬牡蠣皰疹病毒種類。自20世紀90年代以來，由該病毒引起的牡蠣及其他貝類疾病在以歐洲為主要發病區的世界范圍內頻繁爆發，感染幼蟲及貝苗死亡率常常達90%以上，對產業的危害非常嚴重。歐盟也多次出資設立研究基金及組織團隊進行科學研究和疾病的防控指導，并在2010年立法試圖通過限制長牡蠣(Crassostreagigas)的流通及介入監控程序來控制病毒的傳播[2]。

牡蠣皰疹病毒結構上屬于正二十面體有囊膜的病毒，其組成從外到內依次是囊膜、核衣殼及雙鏈DNA形成的病毒核心。病毒基因組大小207.439 kb，基因組結構上包括一個兩端帶有反向重復序列(TRL/IRL, 7.584 kb)的長獨特序列區(UL,167.843 kb)和一個同樣兩端帶有反向重復序列(TRS/IRS, 9.774 kb)的短獨特序列區(US,3.370 kb)，其間是一個更短的獨特序列區X(1.510 kb)，從而形成一個TRL-UL-IRL-X-IRS-US-TRS的基因組組成模式[3]，這個模式代表了大多數已知的不同病毒株，但牡蠣皰疹病毒魁蚶株(OsHV-1-SB)缺少短獨特序列區，其模式為TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS[4]。囊膜蛋白也是組成病毒囊膜的成分，其中糖蛋白Gp與病毒對宿主細胞膜的識別和吸附有關，在選擇壓力下可能會發生高頻的變異[5]。目前病毒有多個變異株流行于世界各地，如歐洲的牡蠣皰疹病毒-1μvar株[6]，我國扇貝的急性病毒性壞死病毒(Acuteviralnecrobioticvirus, AVNV)[7]及牡蠣皰疹病毒魁蚶株[4]。

1 流行情況

1.1 感染宿主

牡蠣皰疹病毒的感染宿主主要為牡蠣，貝苗、幼貝及成貝均可引起感染并死亡，但成貝敏感性及死亡率較低[3,6]。已知多種牡蠣均可感染牡蠣皰疹病毒：歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)[8]、長牡蠣[9]、澳大利亞扁牡蠣(O.angasi)[10]、智利牡蠣(Tiostreachilensis)[11]、葡萄牙牡蠣(C.angulata)[12]、美洲牡蠣(C.virginica)[13]、香港巨牡蠣(C.hongkongensis)[14]等。與牡蠣皰疹病毒不同，急性病毒性壞死病毒在我國主要危害1齡及2齡扇貝[15]。

除牡蠣外，牡蠣皰疹病毒及其變種還可感染其他雙殼類或腹足類：雙殼類簾蛤科的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、溝紋蛤仔(R.decussates)[16]等，扇貝科的歐洲大扇貝(Pectenmaximus)[17]、櫛孔扇貝(Chlamysfarrier)及蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[14]等，蚶科的魁蚶(Scapharcabroughtonii)[4]，貽貝科的紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[18]；腹足類主要感染鮑科的動物，如雜色鮑(Haliotisdiversicolor)[19]、日本盤鮑(H.discusdiscus)[20]、皺紋盤鮑(H.discushannai)[21]等。

1.2 地區分布

牡蠣皰疹病毒最初由Farley發現于美國，20世紀90年代開始在歐洲頻繁爆發，之后在全球各地廣泛流行。牡蠣皰疹病毒及其相關變異毒株在歐洲的分布特別廣泛，從北部的愛爾蘭[22]、英國[16]及荷蘭[23]到南部的意大利[18]、西班牙、葡萄牙[12]等廣大海岸線上都有流行，特別是在法國危害尤其嚴重[17,24]；澳洲主要流行于新西蘭[25]、澳大利亞[26]；美洲主要發生在美國[27]、墨西哥[28]；亞洲主要為中國[4,7,14]、韓國[29]和日本[30]。

與其他毒株較為廣泛的分布屬性不同的是，急性病毒性壞死病毒和牡蠣皰疹病毒魁蚶株兩個毒株僅分布于我國北方沿海，分別危害櫛孔扇貝和魁蚶兩個養殖種類[4,7]。這種在宿主、地理分布等方面的獨特性，也使得國內學者認為急性病毒性壞死病毒是一個新種[31]。其他牡蠣皰疹病毒毒株在我國也存在，但未達到危害的程度，Bai等[14]在山東、遼寧、廣西、廣東、福建等地的養殖貝類中均檢測到陽性樣本，涉及到的種類有櫛孔扇貝、魁蚶、蝦夷扇貝、文蛤(Meretrixmeretrix)、菲律賓蛤仔、香港巨牡蠣、長牡蠣等，檢測到牡蠣皰疹病毒參考株、牡蠣皰疹病毒-1μvar變異株及急性病毒性壞死病毒等諸多病毒毒株。

1.3 流行毒株

該病毒最初在美國發現，但當時只僅限電子顯微鏡進行的形態識別，尚無變異毒株的識別[13]。分子生物學的發展促進了牡蠣皰疹病毒變異株的識別與劃分，在牡蠣皰疹病毒參考株全基因組序列測定的基礎上[3]，又發現了許多變異毒株,如牡蠣皰疹病毒-1var株、牡蠣皰疹病毒-1μvar株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ9株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ15株及中國的牡蠣皰疹病毒魁蚶株和急性病毒性壞死病毒等[6,12,32-33]。這些毒株的出現具有一定的時序性。例如，病毒在法國的發生分為兩個階段，2008年之前流行的主要毒株是牡蠣皰疹病毒-1參考株，而2008年之后流行的毒株以牡蠣皰疹病毒-1μvar株為主[12]。

從起源上來看，基于大量數據的病毒基因多樣性和系統進化樹分析表明，這些毒株具有明顯的分群現象和源流，歐洲流行的牡蠣皰疹病毒-1參考株最初來源于亞洲[9]，而牡蠣皰疹病毒-1μvar株則起源于歐洲[34]。國內的急性病毒性壞死病毒及牡蠣皰疹病毒魁蚶株屬牡蠣皰疹病毒-1系統進化群，牡蠣皰疹病毒-1var株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ9株、牡蠣皰疹病毒-1μvarΔ15株等屬牡蠣皰疹病毒-1μvar系統進化群。

表1 牡蠣皰疹病毒-1及其變異毒株的主要流行國家及感染宿主

1.4 發病季節

已有的大量數據表明，牡蠣皰疹病毒的爆發具有明顯的季節性，即主要集中在夏季這個時間段。例如，北半球的法國，病毒引起貝苗大規模死亡的時間在5—9月[6]，而南半球的澳大利亞，牡蠣皰疹病毒主要流行于11月至次年3月[26]。牡蠣皰疹病毒流行的季節周期性與水溫具有明顯的相關性。報道顯示，牡蠣皰疹病毒多在較高的水溫條件下爆發，低于16 ℃則很少發生重大的貝類死亡事件[35]。例如，在美國西海岸，22～25 ℃是牡蠣皰疹病毒引起的養殖牡蠣爆發性死亡的起始水溫[27]，而在法國，起始水溫最初為19 ℃，但2008年以來牡蠣皰疹病毒-1μvar毒株的出現，使得這一溫度降至16 ℃[38]。這表明水溫可能通過影響宿主生理或者直接影響病毒增殖過程而參與病毒感染機制的調控，從而成為影響牡蠣皰疹病毒流行發展的關鍵因子。

1.5 傳播途徑

牡蠣皰疹病毒可通過多種途徑傳播，包括貝類個體間的水平傳播及垂直傳播、海水傳播、水中顆粒傳播、其他生物傳播等。

感染試驗證明，通過患病貝體，牡蠣皰疹病毒可在貝類種內或種間水平傳播[24,39]。實際上，由于貝類移動性極差，限制了其接觸傳播的機會，但現代化的高密度養殖模式可能使這一過程得以實現[24]。關于垂直傳播，基于親貝性腺內病毒顆粒存在的證據，很多學者認可其存在的可能性[9,37]。但對櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒的研究表明，雖然親貝性腺中存在病毒粒子，但其產生的卵及幼蟲卻未受病毒感染，因此認為病毒存在卵內垂直傳播的可能性較小[40]。很多孵化場的牡蠣幼蟲在孵化后2～3 d就患病死亡，可能是由于水環境中存在的病毒顆粒經其他途徑傳播所致。

此外，其他途徑也是病毒傳播的重要方式。研究發現，牡蠣皰疹病毒能夠在海水中存活一段時間并維持感染力，如果附著或寄生于水中有機顆粒、浮游生物及大型海藻上，則存活及維持感染力的時間更長[41-42]，貝類有可能通過攝食過程接觸這些病毒而感染。因此，海水、水中顆粒物及其他生物均可成為病毒傳播的重要途徑。

2 臨床癥狀及病理特征

2.1 臨床癥狀

自然發病的牡蠣幼蟲表現為食欲和游泳活力的衰退，通常孵化后幾日內即可感染牡蠣皰疹病毒，癥狀出現后5～6 d開始出現嚴重死亡，通常8～10 d全部死亡。瀕死的幼蟲表現為活力減弱，旋轉式游泳，面盤緣膜受損并脫落，此時幼蟲為80～150 μm[36]；變態后的貝類，感染病毒后表現為食欲減退，進食減少，神經損害導致反應遲鈍，閉殼肌收縮緩慢而無力，黏液分泌增加[26]。1～5月齡的苗種通常是急性死亡，5 d內死亡率可達50%～70%，發病1個月后最終死亡率超過90%，稍大規格的貝類，如9～18月齡的幼貝累計死亡率亦達40%～90%。總之，患病貝類的死亡率隨年齡的增大而降低，還隨毒株、環境的不同而變化[6,26]。

人工感染試驗表明，牡蠣皰疹病毒的致病性隨毒株和貝類種類而不同。注射牡蠣皰疹病毒-1參考株后的1齡長牡蠣(殼長40 mm)在2 d后死亡率即達55%，到10 d接近90%。而注射牡蠣皰疹病毒-1μvar后的歐洲平牡蠣，第4 d才出現死亡，10 d后死亡率為25%[43]。牡蠣皰疹病毒-1μvar完全不能在合浦珠母貝(Pinctadamargaritifera)體內增殖，也不能造成死亡[44]。這種敏感性隨貝類種類不同而有差別的現象及原因值得深入探討和研究。

2.2 病理特征

牡蠣皰疹病毒感染引起的組織學損傷在不同貝類之間差別不大，主要發生在外套膜、唇瓣及消化腺的結締組織，表現為結締組織溶解、消化管腫脹及血細胞浸潤現象等[6,37,42]。細胞病變方面，成纖維細胞主要表現為胞漿嗜堿性，細胞核體積增大且染色質邊緣化、凝縮及碎片，球形細胞如血細胞等，表現為細胞收縮，核染色質濃縮，胞漿濃度增大[27,36]。感染急性病毒性壞死病毒的扇貝與牡蠣皰疹病毒-1參考株感染的牡蠣病理特征相似，可見外套膜及鰓等器官的上皮組織細胞腫脹、核固縮、細胞脫落等現象[45]。

2.3 致病機制

臨床試驗通常通過貝類閉殼肌注射而感染病毒，但病毒的早期復制器官卻是心臟[39,46]。而血液循環則將病毒快速傳播至其他組織器官。

病毒感染后可在多個組織器官復制與分布。感染牡蠣皰疹病毒的天然海區牡蠣中，病毒檢出率在消化腺、唇瓣、鰓、外套膜、心臟、閉殼肌等器官依次升高，檢出率為12.5%～75%[9]。而急性病毒性壞死病毒在櫛孔扇貝中主要分布在外套膜、肝胰腺、腎、腸、鰓及閉殼肌等[45,47]。

病毒在宿主體內的復制模式因不同毒株和宿主有所不同。用牡蠣皰疹病毒攻毒的7月齡長牡蠣，2 h后就檢測到多個基因表達，18 h后39個目標基因全部檢出[48]，值得指出的是，所測基因中只有凋亡抑制家族基因在2 h后全部檢出，說明病毒復制時首先對宿主細胞做出調控。而與之不同的是，牡蠣皰疹病毒-1μvar攻毒的9月齡歐洲平牡蠣，48 h后仍未檢測到病毒DNA，直到10 d后才檢測到了病毒DNA[37]。成年魁蚶在牡蠣皰疹病毒攻毒后60 h斧足內病毒復制達到峰值，72 h后血淋巴細胞內病毒復制達到峰值[49]。由此說明，不同病毒毒株、宿主種類及年齡、感染條件等均可影響病毒復制過程和結果，這也從深層次上反應了病毒與宿主互作的復雜性。

Corporeau等[50]應用雙向電泳蛋白質組學的方法，以牡蠣皰疹病毒-1μvar攻毒后2 d的長牡蠣為研究對象，進行了病毒致病機理的研究，發現了25個蛋白斑點顯著變化，包括細胞骨架的解體、蛋白轉化、應急信號的誘導及能量代謝等多個代謝途徑，攻毒的牡蠣細胞表現出了類似癌細胞中的瓦氏效應，如糖酵解及電壓依賴性陰離子通道的增加等。這說明病毒引起了宿主細胞代謝途徑多方面的變化，尤其是能量代謝方式的轉變。這一研究為理解病毒致病機制提供了新的視野。

3 牡蠣皰疹病毒的預防與控制

3.1 海水處理

3.1.1 海水陳化與過濾

牡蠣皰疹病毒不僅在海水中游離存在，更多的是附著于各種顆粒物上，包括浮游生物、飼料、糞便、組織碎片等。因而過濾可以較好的去除海水中的病毒，減少病毒傳播[51-52]。5 μm濾孔過濾后的海水不需紫外線照射，即可防止貝類感染，55 μm濾徑過濾的海水雖不能完全防止貝類受感染而死亡，但也能一定程度上延遲貝類死亡[52]。游離于海水中的病毒，經過2～3 d后基本失去感染能力[41]。海水使用前陳化48 h 能夠有效防止貝類因感染病毒而死亡[41,52]，原因在于，一是陳化使水中顆粒物沉降，二是陳化使病毒失活。

3.1.2 海水消毒

使用合理的消毒程序對海水及貝體消毒，可有效預防牡蠣皰疹病毒傳播。根據Hick等[41]的試驗結果，有效的消毒方式包括化學制品消毒法和物理消毒法。化學消毒劑包括氫氧化鈉(20 g/L，10 min)、碘(1 g/L，5 min)、福爾馬林 (40 g/L，30 min)等；次氯酸鈉(0.05 g/L有效氯，15 min)在相對干凈的海水中有效，但對富含有機質的海水效果較差；商業消毒產品Virkon也是有效的消毒劑。物理消毒法主要為海水加熱(如50 ℃，5 min)和紫外線照射(1000 mW/cm2，10 min)。

3.2 養殖過程中的疾病控制

根據已有研究資料，對于牡蠣皰疹病毒的防控，養殖過程中存在很多可以改善的環節，包括養殖方式、密度、水溫及操作等多個方面。

3.2.1 延長潮間帶養殖貝類的露空時間

延長潮間帶養殖貝類的露空時間可減少染毒貝類的死亡。試驗表明，將成貝的養殖托盤高度提高30 cm，可使成貝的成活率提高2.1～2.5倍[26]。但這種方式并不能提高稚貝或幼貝的成活率，這是因為，一是幼小的貝類能量儲備較少，大部分用于生長消耗，而不能滿足其免疫系統需求[53]，二是幼小的貝類適應力差，延長露空時間降低了其濾食時間，食物攝入的減少及暴露的環境影響了其對病毒的抵抗力。

3.2.2 降低養殖密度

高密度養殖模式使貝類生活空間局促，體質下降，病毒傳播距離縮短，從而加劇了病毒的爆發與流行。甚至有學者認為，牡蠣皰疹病毒源自養殖貝類[54]。為了避免病毒的爆發，有必要降低養殖密度。

3.2.3 水溫

如上所述，較高的水溫是牡蠣皰疹病毒爆發的重要條件，水溫動力學與病毒感染模式具有極大的相關性。研究表明，水溫降至16 ℃以下雖然不能阻止病毒的復制與傳播，但可控制感染貝類的死亡狀況[35,38,54]。因此，實際養殖中，室內水池等可控水體可直接將水溫降低2～3 ℃，而海區大水面可通過調節水層來降低水溫，進而控制貝類死亡。

3.2.4 其他因素

食物質量與豐度也影響病毒的危害性，以硅藻為主要食物來源的貝類，能量儲備較為充足，一定程度上能夠降低病毒帶來的危害[52,54]。應激(如人工操作、運輸、擁擠、餌料的變化、殺蟲劑及繁殖等)也會導致貝類免疫力下降，容易感染病毒。因此，在實際養殖中應注意加強管理，降低應激的發生。

4 展 望

牡蠣皰疹病毒在世界各地廣流泛行，給牡蠣及貝類產業造成了巨大損失，對其深入研究迫在眉睫。目前已經在基因組學、流行病學等方面對該病毒進行了一定的研究，新的檢測技術也不斷涌現并得到應用。但目前對其爆發的機制缺乏足夠的了解，以致難以預測其爆發趨勢。另一方面，對該病毒致病的分子機制尚缺乏了解，因此需要結合基因組學、蛋白質學及代謝組學的原理及技術對病毒吸附、入侵、繁殖、擴散等各個環節進行深入研究，為病毒的防治提供理論支持。另外，對牡蠣皰疹病毒的防控還缺乏有效措施，這是因為貝類體型小、生活環境開放性大，缺乏后天免疫，有效藥物及疫苗的開發和使用難度較大。因此，應該在三個方面加強對疾病的防控：一是加強病毒生態學及致病機制的研究，以便在養殖模式及管理方法上形成有效控病手段，要特別重視環境因子和養殖管理在控制及延遲病毒引起的大規模死亡方面的重要作用；二是加強病毒區域性分子流行病學的調查研究，探明地方主要流行毒株及其危害，有針對性的進行致病性機制及其防控的研究；三是基于貝類對病毒敏感性差異較大的特點，加強育種研究，開發抗病力強的新品種，對防病具有重要的意義。