叉尾斗魚肉瘤病的病理學檢測和病原鑒定

劉怡南，彭 爽，王 虹，陳德芳，賀 揚，周 毅，耿 毅

( 1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130； 2.四川農業大學 動物科技學院 水產系， 四川 成都 611130； 3.四川農業大學 生命科學學院，四川 雅安 625014 )

叉尾斗魚(Macropodusopercularis)屬鱸形目、攀鱸亞目、絲足鱸科，為小型淡水觀賞魚類；其色彩艷麗、體形優美，備受各國觀賞魚愛好者追捧，被譽為“天堂魚”[1]。叉尾斗魚肉瘤病是養殖過程中出現的一種慢性皮膚瘤，主要癥狀為患病魚的頭部、軀干和鰭條聚集出現成串或成團的白色半透明狀囊腫物；該病不會導致魚類大規模死亡，但會嚴重影響觀賞價值。1975年澳大利亞學者最早描述了叉尾斗魚體表出現的“覆盆子樣”增生物，報道指出其具有典型的淋巴囊腫細胞結構[2]。虹彩病毒科的淋巴囊腫病毒(Lymphocystisdiseasevirus)被認為是魚類淋巴囊腫病的病原，其可感染全球范圍內超過125種硬骨魚類，引起魚類淺表組織出現慢性增生性囊腫，疾病給水產養殖業造成巨大經濟損失[3]。在我國，養殖魚類云紋石斑魚(Epinehelusmoara)[4]和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5-6]是淋巴囊腫病毒的易感宿主；2014年Xu等[7]研究證實虹彩病毒科淋巴囊腫病毒也是叉尾斗魚重要的病原。

2015—2016年四川某觀賞魚店先后多批自廣東購進的叉尾斗魚體表均出現肉瘤狀增生物，疑似為淋巴囊腫病毒感染。為確定病原，筆者收集患肉瘤病病魚，進行了病理學檢測和增生物主要衣殼蛋白基因序列分析，為叉尾斗魚肉瘤病臨床診斷和預防提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病叉尾斗魚體長5～10 cm，8～12月齡，購自廣東惠州某斗魚養殖場；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；D2000 Marker和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病理學觀察

采用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉患病魚致死，體表病變觀察并剖檢，記錄病理變化并拍照。

1.3 組織病理學觀察

采集皮膚、鰓、心、肝、脾、腎、腦和腸組織，室溫固定于4%多聚甲醛中，常規石蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅染色，光學顯微鏡觀察增生物形態和組織病理變化，并拍照，Image-Pro Plus 6.0用于細胞大小測定。

1.4 組織透射電鏡觀察

取皮膚體表肉瘤狀增生物，固定于2.5%戊二醛，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾—枸櫞酸鉛雙染色透射電鏡觀察病毒形態，并拍照。

1.5 淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白基因檢測

以肉瘤樣增生組織中的基因組DNA為模板，利用淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白基因引物MCP-F(5′-ATGACTTCTGTAGCGGGTTCAAGTG-3′)和MCP-R(5′-CTAAAGTACAGGAAATCCCATTGAAC-3′)進行PCR擴增[7]。反應條件： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 2 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段送上海生物工程有限公司測序。測序結果在美國國立生物技術信息中心進行BLSAT比對分析，采用Mega 4.1構建進化樹。

2 結 果

2.1 病變觀察

體表肉瘤狀增生物呈白色或灰白色，半透明球形小顆粒狀，單個成片或堆積成團，集中分布在患病魚的背鰭、臀鰭、尾鰭及鰭條基部區域(圖1a)。增生物早期主要散布于鰭條上，逐漸增多堆積成團伴有鰭條充血(圖1b)，嚴重時出現蛀鰭，增生物成片擴散蔓延至體表，魚體體色明顯變淡(圖1c)。解剖觀察，鰓絲輕微腫脹，內臟未見明顯異常。

2.2 組織病理觀察

體表肉瘤狀增生物是由大量直徑約48.7～217.8 μm(n=11)的囊腫細胞聚集形成。皮膚上大小不等的球形囊腫細胞相互擠壓堆積出現在真皮層，囊腫細胞間有大量浸潤的炎性細胞和增生的上皮細胞，真皮層中黑素細胞聚集減少，而皮下肌肉組織結構清晰、肌細胞排列整齊無明顯病變(圖2a)。鰓絲腫脹增厚，鰓小片呼吸上皮浮離，基底黏液細胞增多，炎性細胞浸潤(圖2b)。脾臟出血，白髓區域減小(圖2c)。其他組織器官無明顯病變。

圖1 體表病變a.對照(上)，鰭條感染(中)，體表感染(下)；b：鰭條充血；c：蛀鰭.

圖2 組織病理變化a.皮膚；b：鰓絲；c：脾臟. E: 表皮；D: 真皮；M: 肌肉；PL: 鰓絲；Epc: 呼吸上皮；Mc: 黏液細胞；Ⅰ:脾臟出血；Ⅱ:白髓減少.

囊腫細胞僅出現在皮膚和鰭條上，在鰓、脾、腸、肝、腎等內臟組織中均未觀察到囊腫樣異常肥大細胞。正常細胞直徑為5.1～6.4 μm，囊腫細胞大小為正常細胞大小的57.9～1823.8倍(按面積計算)。典型的囊腫細胞核深染位于細胞一側，染色質成團聚集；細胞質邊緣有大量網狀嗜堿性包涵體，細胞膜為均質透明細帶狀(圖3a)；膜外單層毛細血管包裹滋養著感染階段的囊腫細胞(圖3b)，衰老的囊腫細胞縮小，細胞膜均質變厚，破裂，胞內物質降解(圖3c)。

2.3 透射電鏡觀察

體表肉瘤狀增生物在透射電鏡下可觀察到大量形態一致的病毒粒子分布于囊腫細胞胞質內，直徑約(171.5±1.2) nm，具有衣殼，切面呈六邊形對稱結構(圖4)。

圖3 囊腫細胞的顯微結構a.典型囊腫細胞；b：感染階段細胞；c:降解階段細胞. N: 細胞核; I: 胞質包涵體; H: 透明被膜; C: 毛細血管; M: 黑素細胞; IE: 炎癥上皮樣細胞; D: 降解細胞.

圖4 透射電子顯微鏡觀察a.17 000×; b:40 000×.

2.4 病毒檢測及發育樹分析

以肉瘤狀增生物組織提取的基因組DNA為模板，采用通用引物對淋巴囊腫病毒基因主要衣殼蛋白基因進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察可見在1000～2000 bp間出現單一條帶(圖5)，回收產物測序獲得1272 bp的堿基序列，將序列在美國國立生物技術信息中心數據庫中進行Blastn比對，其與淋巴囊腫病毒(登陸號 KJ408271.1)主要衣殼蛋白的序列相似性達99%。與19株不同種屬的虹彩病毒進行系統發育樹構建，結果表明，感染病毒株屬于虹彩病毒科中淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)，明顯區別于腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus)和蛙病毒屬(Ranavirus)；其與同為觀賞魚來源的序列KJ4408271.1和AB299163.1聚為一簇，與同為叉尾斗魚來源的毒株親緣關系最近(圖6)。

圖5 PCR擴增結果1.DL2000 Marker; 2:陰性對照; 3、4:增生物樣品; 5:DL2000 Marker.

圖6 基于主要衣殼蛋白基因的系統發育樹

3 討 論

叉尾斗魚肉瘤病是一種體表慢性皮膚瘤，疾病病程長，雖然死亡率不高，但會使患病魚喪失觀賞價值；隨著觀賞魚全球貿易的拓展，以觀賞魚為宿主的病毒性疾病傳播對各國疾病診斷和檢疫工作提出了新的要求。本研究對采集的叉尾斗魚肉瘤病病魚進行檢測，結果顯示,體表白色或灰白色、半透明球形顆粒瘤狀增生物是由異常肥大的囊腫細胞堆積而成，囊腫細胞是由淋巴囊腫病毒感染所致。這與報道淋巴囊腫病毒感染形成典型的皮膚淺表增生物相一致[7-8]。

虹彩病毒科分為5個屬，其中感染脊椎動物的是蛙病毒屬、腫大細胞病毒屬和淋巴囊腫病毒屬。病毒主要衣殼蛋白基因被認為是虹彩病毒科內病毒鑒定的理想目的基因。本試驗擴增測序得到1272 bp的主要衣殼蛋白基因片段，在線比對與淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白基因相似性達99%。叉尾斗魚屬于脊椎動物硬骨魚類，早期研究顯示，其是虹彩病毒科腫大細胞病毒的易感宿主[9]。試驗系統發育樹分析結果顯示，感染病毒與腫大細胞病毒明顯進化差異，其與淋巴囊腫病毒聚為一簇，且與淋巴囊腫病毒同為斗魚分離株的KJ408271.1親緣關系最近，表明叉尾斗魚肉瘤病病原為淋巴囊腫病毒。淋巴囊腫病毒廣泛分布于天然水體中，是危害魚類健康的重要病毒性病原之一。淋巴囊腫病毒與靶細胞膜上受體綁定通過內吞或膜融合方式進入胞內[10]；病毒通過抑制靶細胞凋亡和細胞分裂為病毒復制贏得時間，同時刺激細胞聚變促使靶細胞異常腫大[11]。淋巴囊腫病毒復制在胞質內形成包涵體，病毒DNA和蛋白質在其內裝配完成后，脫離包涵體進入胞質，待細胞裂解后釋放到組織中。本試驗觀察到在異常肥大的囊腫細胞內有大量的嗜堿性包涵體，電鏡顯示其胞質內含有裝配成熟的六邊形病毒粒子。同時，病毒感染可以上調膠原纖維相關基因表達，在感染細胞表面形成透明被膜[11]。本試驗觀察到，在囊腫細胞被膜隨著病毒的感染增厚，衰老的囊腫細胞雖然細胞縮小，但有的囊膜明顯增厚。此外，在感染階段典型的囊腫細胞被膜外包裹有單層毛細血管，細胞與細胞間毛細血管豐富，這些血管支持著腫瘤細胞的新陳代謝。若在疾病治療中能有效控制囊腫區域局部血液供應，將為肉瘤病的治療提供新的方法。

淋巴囊腫病毒最主要的靶器官是體表皮膚下的結締組織，也可感染鰓、脾、體腔膜、腸和頭腎等組織器官，褐牙鲆感染可在魚體表、鰓、腸壁、肝、頭腎、脾中觀察到囊腫細胞，而花鱸(Lateolabraxjaponicus)則僅在鰓上觀察到典型囊腫細胞[12]。本試驗僅在皮膚和鰭條觀察到典型囊腫細胞，病變細胞局限在真皮層，其他臟器未見典型囊腫細胞或異常腫大細胞，且叉尾斗魚臟器病變較易感動物褐牙鲆等的病理變化輕微，表明叉尾斗魚淋巴囊腫病毒感染局限在體表，皮膚和鰭條是其感染的靶器官。養殖過程中，叉尾斗魚在4～8月齡時達到性成熟，繁殖期打斗嚴重，外傷加大淋巴囊腫病毒感染風險。臨床肉瘤狀增生物出現在打斗易損傷的鰭條及基部區域，結合組織病理學觀察，推測叉尾斗魚感染主要途徑為經皮膚感染。本研究對大體癥狀的觀察和病理學研究為叉尾斗魚肉瘤病的診斷和預防提供依據。